Los pequeños extractos nucleares para ensayos funcionales de los mecanismos de expresión de genes

El objetivo general del siguiente experimento consiste en analizar la expresión génica utilizando maquinarias nucleares funcionales extraídas de células. Para lograrlo, primero se recolectan y hinchan las células HeLa. A continuación, las células se rompen mediante descenso y luego se centrifugan para obtener un sedimento de núcleos en el tercer paso.

Los núcleos se extraen con sal, se concentran y se dializan para obtener maquinarias funcionales y solubles de expresión génica. En última instancia, la funcionalidad de los extractos nucleares puede evaluarse en función de sus actividades de transcripción y empalme, evaluadas mediante un sistema acoplado de ARN polimerasa para transcripción y empalme. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la preparación de extracto nuclear en bloque, es que con esta técnica puede utilizarse una pequeña cantidad de células para preparar el extracto nuclear.

Comience sembrando células HeLa en tres placas de 150 milímetros con medio DMEM suplementado con SFB y antibióticos; cultive las células en un incubador a 37 grados Celsius con 5% CO₂ hasta que las células alcancen una confluencia del 90%. En ese momento, aspire el medio de los cultivos celulares HeLa y lávelos una vez con 13 mililitros de PBS a temperatura ambiente por placa, luego aspire el PBS. Coloque cada placa de lado durante unos segundos y aspire el resto del PBS.

A continuación, utilice un levantador de células para raspar las células hacia el borde inferior de cada placa y luego transfiera las células a un tubo eppendorf de 1,5 mililitros. Finalmente, haga un pellet de las células en una microcentrífuga durante cinco minutos a cien veces G y a cuatro grados Celsius. Ahora aspire el PBS del pellet celular y estime el volumen celular empaquetado o PCV observando la graduación del tubo.

Luego, agregue un volumen doble de tampón hipotónico respecto al VCP al sedimento celular. Agite suavemente el tubo para resuspender. Las células se desagregan pipeteando suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1000 microlitros según sea necesario.

Luego, pelletice las células bajo las mismas condiciones de centrifugación que antes. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente la capa del tampón hipotónico. Las células habrán comenzado a hincharse y el volumen celular habrá aumentado a aproximadamente 750 a 1000 microlitros.

Añada nuevo tampón hipotónico hasta un volumen final de 1,5 mililitros y resuspenda las células en el tampón. Una vez más, finalmente, incube las células hinchadas resuspendidas en hielo durante 10 minutos mientras las células se enfrían. Enjuague un homogenizador Dounce con tampón hipotónico y luego colóquelo en hielo junto con las células.

Luego, utilizando una toalla de tarea delicada, como una toalla Kim, seque el pistilo. Use una punta de micropipeta extendida de 1000 microlitros para retirar el tampón de los tubos. Ahora use la pipeta para transferir las células hinchadas y frías a los tubos.

La parte más complicada de este procedimiento consiste en verificar con éxito la lisis. Después de cada homogenización, mueva lentamente el pistilo ajustado del homogenizador hacia arriba y hacia abajo cinco veces para lisar las células, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas. A continuación, transfiera cinco microlitros de la suspensión celular lisada a un tubo eppendorf y agregue 10 microlitros de azul de tripano y 15 microlitros de PBS 1X.

Agregue la solución celular a un portaobjetos y examine las células bajo un microscopio óptico para observar la lisis; los núcleos de las células lisadas aparecerán azules después de tres onzas. No hay suficiente lisis, ya que son visibles numerosas células vivas. Después de cinco onzas, hay suficiente lisis.

Finalmente, transfiera las células lisadas al tubo Eppendorf previamente enfriado y centrifugue la suspensión celular durante cinco minutos en una microcentrífuga a 1500 × g y 4 °C. Luego, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo sin perturbar el botón celular. Ahora, estime el volumen nuclear en el punto o PNV observando la graduación del tubo.

Llene la punta de una micropipeta con tampón de baja salinidad hasta la mitad del VNP. Luego inserte la punta de la micropipeta en los núcleos situados en el fondo del tubo einor. Inyecte lentamente el tampón en los núcleos mientras mezcla suavemente.

Agite suavemente el tubo para asegurarse de que el precipitado se resuspenda completamente. A continuación, agregue tampón de alta salinidad a la mitad del volumen de PNV y mezcle rápidamente una vez invirtiendo el tubo. Incube el tubo en rotación durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.

Finalmente, centrifugue los núcleos en la microcentrífuga durante 15 minutos a 18.000 × g y 4 grados Celsius. Comience transfiriendo 500 microlitros del sobrenadante a microtubos fríos. Centrifugue el extracto nuclear de alta sal durante 15 minutos a 14.000 × g y 4 grados Celsius; tras la centrifugación, invierta el minicolumna y colóquela en un nuevo tubo individual de EOR.

Después de centrifugar durante dos minutos a 1000 veces G y cuatro grados Celsius, el extracto nuclear de alta sal se concentrará a aproximadamente 115 microlitros. Ahora transfiera alícuotas de 45 microlitros del extracto nuclear de alta sal a los SLI de diálisis miniatura. Asegúrese de que la parte inferior de la placa esté alineada con la parte inferior del flotador.

Luego, coloque los SLI en 500 mililitros de tampón de diálisis frío. Finalmente, agite las alícuotas durante una a dos horas a cuatro grados Celsius; el extracto nuclear aparecerá turbio tras la diálisis. Esta figura muestra datos representativos que comparan una reacción acoplada de transcripción y empalme del ARN polimerasa dos en un extracto nuclear a pequeña escala frente a un extracto nuclear en masa.

Cuando se incubó el constructo A-C-M-V-D-N-A en extractos a gran escala o a pequeña escala, se sintetizaron niveles similares del preARN mensajero naciente en el punto temporal de cinco minutos tras la adición de alfa y manina para bloquear la transcripción adicional; los intermediarios de empalme y los productos de empalme se acumularon con el tiempo con cinéticas similares en ambos tipos de extractos. Estos resultados representativos confirman que las eficiencias del sistema acoplado de transcripción por la ARN polimerasa II y empalme son similares en los extractos nucleares a gran escala y a pequeña escala. Para demostrar la utilidad del extracto a pequeña escala, se prepararon extractos a partir de células HeLa tratadas con el inhibidor de empalme E 7 1 0 7 o con el compuesto de control negativo Platy analy F, y luego se realizó un ensayo acoplado de transcripción por la ARN polimerasa II y empalme como se muestra en esta figura; la transcripción por la ARN polimerasa II ocurrió eficientemente en extractos preparados a partir de células tratadas con plaid F y con E 7 1 0 7.

En contraste, el empalme ocurrió normalmente en el extracto preparado a partir de las células tratadas con analy F, pero se abolió en las células tratadas con E 7 1 0 7. Estos datos proporcionan una prueba de concepto para el uso de extractos nucleares a pequeña escala tras el tratamiento especial de células a pequeña escala. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en menos de cinco horas.