Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la detección de micro metástasis en pulmón de ratón ex vivo, mientras se conserva la arquitectura de los pulmones inflados. Esto se logra primero mediante la perfusión del pulmón in situ con PBS para eliminar la sangre, que es la principal fuente de fondo de color en ese tejido. Los siguientes pasos consisten en inflar el pulmón mediante inyección de PFA y luego ocluirlo para fijar el tejido pulmonar bajo inflación.

A continuación, se extrae el pulmón y se fija adicionalmente en PFA, o bien se incluyen lóbulos pulmonares individuales para su inclusión en criosección. Los pasos finales consisten en teñir los tejidos con solución Xal y visualizar las células tumorales LA zag; finalmente, las metástasis pueden detectarse en lóbulos pulmonares completos o en secciones de tejido pulmonar, hasta el nivel de célula individual, mediante un microscopio binocular o un microscopio óptico. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la técnica de sky standing por sí sola, es que la detectabilidad de las micrometástasis mejora considerablemente debido a la eliminación del fondo relacionado con la sangre.

Comience el protocolo anestesiando un ratón mediante una inyección intraperitoneal de ketamina, xilazina y acepromazina en aproximadamente 150 microlitros de PBS. Cuando ya no se observen los reflejos de dolor del ratón, fíjelo sobre la mesa de operaciones. Retire el vello y limpie con etanol al 70 %.

Abrir la piel desde el abdomen hasta el cuello. Tirar de la piel hacia los lados o retirarla. Abrir cuidadosamente el peritoneo en el tórax para evitar la ruptura de grandes vasos como las venas yugulares.

Esto mejorará la eficiencia de la perfusión. Ahora corte la vena cava cardis debajo del hígado utilizando una jeringa de 20 mililitros con una aguja de calibre 21 a 24. Inyecte lentamente 10 a 15 mililitros de PBS en el ventrículo derecho del corazón en movimiento hasta que el pulmón quede completamente blanco y el corazón deje de latir.

Luego, ocluya los vasos sanguíneos por encima del hígado y el diafragma con un clamp vascular. Cargue una jeringa de 10 mililitros con paraformaldehído al 3% y, utilizando una aguja de calibre 21 a 24, inyecte en el ventrículo derecho. Aproximadamente dos mililitros.

Descubra la tráquea fuera de la cavidad torácica e infle el pulmón mediante una inyección en la tráquea de aproximadamente tres mililitros de aldehído desde fuera de la cavidad torácica. Luego, inmediatamente después de retirar la aguja, ocluya la tráquea en el sitio de la punción con una pinza vascular y espere 10 minutos para permitir la fijación. A continuación, seccione los vasos sanguíneos por encima de la pinza vascular.

Luego retire la pinza e inyecte aproximadamente dos mililitros de PBS en el ventrículo derecho para eliminar el formaldehído en exceso. Perfore con una aguja las partes inferiores de todos los lóbulos pulmonares y retire la pinza vascular de la tráquea. Ahora inyecte de tres a cinco mililitros de solución de inclusión diluida en la tráquea, administrada de forma similar a la otra inyección.

Detenga la inyección cuando el paraformo que se encuentra en los lóbulos pulmonares sea reemplazado por la solución. Retire cuidadosamente el pulmón tirando del corazón con una pinza y seccionando los ligamentos de tejido conectivo, los vasos sanguíneos y la tráquea. Asegúrese de mantener el corazón conectado a los pulmones.

Reserve un lóbulo para cortes en criosección y utilice el tejido pulmonar restante para la tinción completa del pulmón. Coloque el pulmón en un vaso de plástico con tapa hermética y fíjelo con formaldehído al 2 % en PBS. Coloque un trozo de gasa encima del pulmón para mantenerlo sumergido en la solución y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de media hora, retire la solución de fijación y lave el tejido exhaustivamente con PBS tres veces. Prepare frescamente la solución de Xal lista para usar diluyendo un mililitro de la solución stock de Xal, uno a 40, en la solución básica de tinción y agregue al menos 10 mililitros de esta solución al recipiente. Sumerja el pulmón con un trozo de gasa. Coloque la tapa flojamente para permitir el intercambio de aire e incube a 37 grados Celsius durante tres a cinco horas protegido de la luz.

Después de la incubación, elimine la solución de xal. Enjuague los pulmones una vez con PBS para eliminar la solución de xal residual y agregue al menos 10 mililitros de paraformaldehído al 4 % en PBS. El tejido ya está listo para histología y puede almacenarse durante mucho tiempo en PFA al 4 % a cuatro grados Celsius.

Comience llenando un tercio de un molde de inclusión con medio de inclusión poly forze sin diluir. Luego, coloque el lóbulo pulmonar en el molde y continúe agregando medio hasta que el lóbulo quede completamente cubierto. Evite cuidadosamente la formación de burbujas de aire y, a continuación, incube el lóbulo incluido a cuatro grados Celsius durante 20 minutos.

A continuación, prepare los pulmones incluidos para su corte mediante congelación lenta en una mezcla de hielo seco y isopentano. Si es necesario, ahora pueden transferirse a un congelador de menos 80 grados Celsius para su almacenamiento. En un criostato, corte secciones criogénicas de siete a 10 micrómetros del lóbulo. Monte las secciones en portaobjetos disponibles comercialmente, listos para secciones criogénicas. Una vez montadas, incube inmediatamente las secciones en solución de tinción Xal a 37 grados Celsius durante 24 horas en una cámara humedecida. Al día siguiente, enjuague los portaobjetos con PBS dos veces, cinco minutos por cada enjuague.

A continuación, realice un breve enjuague con agua destilada. Ahora contratiña los portaobjetos con rojo nuclear rápido durante 10 segundos para obtener una contratincción débil que haga que la xal sea más dominante, y enjuague inmediatamente la contratincción con agua destilada. Para una contratincción más intensa, prolongue el tiempo hasta 30 segundos o más.

Monte las laminillas con inmuno montaje. Se volvió a investigar la formación de metástasis en los modelos de OS murinos con LM ocho. Utilizando las imágenes representativas descritas aquí de pulmones perfundidos y no perfundidos de ratones inyectados simultáneamente con células de LM ocho transducidas con laxy y no transducidas con control, y células inyectadas con células de control.

Las metástasis macroscópicas y microscópicas permanecieron indetectables en los pulmones no perfundidos y perfundidos. Pero, de forma interesante, en los ratones inyectados con células dun LA Z, la tinción xgl reveló focos azules micrometastásicos de células individuales o pequeños grupos celulares en la superficie de los pulmones no perfundidos. La perfusión y fijación in situ de los pulmones mejoraron aún más la detectabilidad de las micrometástasis dun la z; sin embargo, no se observó crecimiento hacia focos macroscópicos en los ratones inyectados con células control LM ocho. En los pulmones no perfundidos, se reconocieron focos macrometásticos translúcidos, apenas detectables, mayores de 0,1 milímetros de diámetro. La perfusión del pulmón no mejoró la detección de estos focos.

Sin embargo, en ratones inyectados con células LAC Z, se detectaron múltiples metástasis macroscópicas azules por tinción con X-gal en la superficie de órganos no perfundidos. También se detectaron metástasis microscópicas en la superficie de órganos no perfundidos. Además, la perfusión de los pulmones mejoró aún más la detección de metástasis macroscópicas y microscópicas.

En consecuencia, las metástasis micro y macro se volvieron visibles con una densidad mayor y un tamaño más amplio, principalmente debido a la transparencia del tejido perfundido, en el cual también se hicieron visibles los focos situados debajo de la superficie del órgano. Un análisis histológico adicional mediante secciones criostáticas de tejido pulmonar confirmó la mayor detectabilidad de las metástasis pulmonares en ratones inyectados con células LAX Z transducidas y células LM ocho en ratones con tumores primarios derivados de células Dun LAX Z. Se identificaron metástasis microscópicas o incluso focos de células individuales en secciones pulmonares.

Esto no se observó en ratones con tumores primarios de las células de control respectivas. Además, las metástasis macroscópicas también fueron más claramente visibles en ratones inyectados con células LM ocho LA C que en los animales con las células de control LM ocho. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la perfusión y fijación pulmonar en ZI dos y la posterior tinción de la metástasis en los pulmones extirpados.

Esta técnica es un método altamente sensible para evaluar la distribución de metástasis en el pulmón en cualquier tipo de estudio de cáncer, y también puede servir como referencia para mejorar las técnicas actuales de imagen in vivo, como la micro-TC, la PET y la RMN utilizadas en la detección temprana de lesiones metastásicas.