Una evaluación cuantitativa de la migración celular mediante el ensayo de la canción Motilidad Phagokinetic
4 de diciembre de 2012
El ensayo de motilidad phagokinetic track es un método usado para evaluar el movimiento de las células. Específicamente, el ensayo mide la quimiocinesis (motilidad celular aleatoria) en el tiempo de una manera cuantitativa. El ensayo se aprovecha de la capacidad de las células para crear una pista medible de su movimiento en coloidales de oro revestido con cubreobjetos.
El objetivo general de este procedimiento es poder medir cuantitativamente la motilidad celular a lo largo del tiempo mediante un ensayo de motilidad celular basado en nanopartículas de oro. Esto se logra primero preparando láminas de vidrio para un recubrimiento de nanopartículas de oro. Específicamente, las láminas libres de endotoxinas se recubren con gelatina y luego se hornean.
El segundo paso consiste en reducir el ácido cloráurico, lo que generará nanopartículas de oro y permitirá recubrir uniformemente las laminillas recubiertas con gelatina con la solución. A continuación, las células se colocan sobre las laminillas recubiertas con nanopartículas de oro durante el período de tiempo deseado del experimento. Posteriormente, la gelatina desplazará las nanopartículas de oro, creando rastros.
El paso final consiste en la monitorización y cuantificación de la motilidad celular mediante microscopía para obtener imágenes de las trayectorias creadas por las células en movimiento. Finalmente, se realizan mediciones del área de las trayectorias utilizando software de acceso gratuito. Una de las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, como la imagenología con intervalos de tiempo, es que este ensayo requiere únicamente un microscopio óptico estándar, una cámara convencional y emplea software de imágenes disponible gratuitamente.
Además, el ensayo permite fácilmente el análisis y la comparación de múltiples muestras utilizando un método capaz de cribado de alto rendimiento. Aunque este método puede proporcionar información sobre la influencia de diferentes factores fisiológicos y el movimiento celular, también puede aplicarse a otros sistemas, como los estudios sobre los efectos que los patógenos tienen sobre la motilidad de las células infectadas. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque el método requiere seguir estrictamente los volúmenes y temperaturas indicados en el protocolo.
En este protocolo, se hace hincapié en evaluar el color de la solución final de nanopartículas de oro precipitadas para asegurar el éxito. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos del ensayo de motilidad cinética de FGO son difíciles de aprender.
Contienen varios procedimientos que no se utilizan comúnmente en laboratorios de biología celular y molecular. Para preparar cubreobjetos recubiertos con gelatina, primero resuspenda la gelatina en agua desionizada para obtener una solución con una concentración final de 0,5 gramos por 300 mililitros, luego autóclave la mezcla durante 15 a 30 minutos. Es importante realizar esto dentro de las dos horas siguientes a la adición de la gelatina en una cabina de cultivo celular.
Prepare las laminillas para el recubrimiento transfiriendo primero de ocho a nueve laminillas lavadas con ácido a una placa de plástico de 100 milímetros. Asegúrese de que las laminillas no se toquen entre sí ni con los bordes de la placa. Pipetee cuidadosamente de dos a tres gotas de gelatina sobre cada laminilla, evitando el desbordamiento sobre la placa.
Luego, coloque el recipiente que contiene las laminillas recubiertas con gelatina en un horno y hornee a 90 grados Celsius durante 10 minutos. Después de 10 minutos, retire el recipiente del horno y devuélvalo a la campana de cultivo de tejidos.
Aspire suavemente cualquier exceso de gelatina. Devuelva el recipiente al horno y seque las laminillas a 70 grados Celsius durante 45 minutos. Una vez que las laminillas estén secas, retire el recipiente del horno y devuélvalo a la campana de cultivo de tejidos.
Con una aguja estéril y delicadamente, levante un lado del cubreobjetos. Luego, utilice pinzas estériles para retirar los cubreobjetos recubiertos con gelatina del recipiente y colóquelos en pozos separados de una placa de 24 pozos. El siguiente paso consiste en preparar cubreobjetos recubiertos con oro coloidal.
Comience preparando 10 mililitros de una solución al 0,5 % de citrato de sodio, trabajando en una cabina de cultivo celular. Combine 1,5 mililitros de la solución de ácido cloroórico 14,5 mM con 13,5 mililitros de agua desionizada autoclavada en un matraz Erlenmeyer estéril y libre de endotoxinas. Por cada ocho o nueve cubreobjetos, el resultado debe ser una solución ligeramente amarilla. El ácido cloroórico es tóxico y debe manipularse con cuidado. Además, es sensible a la luz, por lo que el paso de ebullición debe realizarse en un entorno con poca luz.
Cuando la solución haya alcanzado su punto de ebullición, retire el matraz de la placa calefactora y transfiéralo a una placa agitadora. Con el fin de formar las partículas coloidales de oro en la solución, agregue 0,7 mililitros de la solución de citrato de sodio al 0,5 % por cada 15 mililitros de la solución de ácido clorOÁURICO mientras agita; continúe agitando durante aproximadamente dos minutos. Durante este tiempo, la solución cambiará de un amarillo tenue a transparente, luego a gris, a púrpura y finalmente a un púrpura intenso.
Antes de alcanzar finalmente un color rojo vino o preferiblemente color óxido, aspire la solución de oro coloidal en una pipeta de 10 mililitros y deje que la solución se enfríe en la pipeta durante uno o dos minutos hasta que alcance la temperatura ambiente. Luego, agregue de 0,5 a un mililitro encima de las laminillas recubiertas con gelatina en la placa de 24 pocillos. Coloque la placa de 24 pocillos que contiene las laminillas cubiertas con oro coloidal en un incubador a 37 grados Celsius e incube durante 30 minutos. Después de que las partículas hayan tenido tiempo de sedimentar sobre las laminillas recubiertas con gelatina, verifique su densidad bajo un microscopio de luz.
La distribución adecuada de nanopartículas de oro ayuda a distinguir de forma fácil y eficiente los bordes de las células solares. La densidad óptima varía según el tamaño de la célula. Una concentración de partículas de oro demasiado alta dificulta la capacidad de las células para moverse, mientras que una concentración de partículas de oro demasiado baja limita la capacidad de delinear una trayectoria precisa de motilidad.
Por esta razón, solo deben usarse juntos en experimentos individuales portaobjetos fabricados en el mismo lote o que se hayan normalizado para tener la misma densidad. Si la concentración de partículas de oro es insuficiente, añada entre 0,5 y un mililitro adicional de la solución de oro coloidal a los portaobjetos recubiertos con gelatina. Sin embargo, si la concentración de partículas de oro es demasiado alta, como en el caso mostrado aquí, la única opción efectiva es volver a preparar la solución de oro coloidal y recubrir nuevos portaobjetos.
Si la densidad de partículas es correcta, devuelva la placa al incubador a 37 grados Celsius e incube durante una hora hasta toda la noche. Enjuague las partículas de oro no unidas sumergiendo los cubreobjetos tres veces en solución salina tamponada con fosfato estéril. Luego, almacene los cubreobjetos recubiertos con oro coloidal en pocillos llenos de PBS de una placa limpia de 12 pocillos a cuatro grados Celsius hasta que estén listos para su uso. No se debe permitir que los cubreobjetos se sequen y deben utilizarse dentro de los dos o tres meses siguientes a la fecha de su elaboración.
El siguiente paso consiste en preparar las cubetas recubiertas con oro coloidal para el cultivo celular. Comience colocándolas en pozos individuales de una placa de 24 pozos que hayan recibido previamente aproximadamente 0,3 mililitros de medio de cultivo antes de añadir las cubetas. Transfiera aproximadamente de 5 000 a 50 000 células a cada cubeta recubierta con oro coloidal. El número de células variará según el tipo celular, pero la densidad celular debe ser lo suficientemente baja como para evitar el solapamiento de las trayectorias celulares de múltiples células en la misma zona.
Cubra la placa y colóquela en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante seis a 24 horas. En función de la movilidad del tipo celular, el marco temporal óptimo debe determinarse experimentalmente para cada tipo celular. Tras la incubación, fije cualquier cubreobjetos que no se analizará de inmediato sumergiéndolo primero dos veces en PBS, seguido de una incubación en paraformaldehído al 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Capture imágenes de las trayectorias creadas por una sola célula en movimiento sobre cubreobjetos no fijados o fijados. La magnificación utilizada para tomar imágenes de las trayectorias celulares varía según el tipo celular. Sin embargo, debe utilizarse la misma magnificación en cada estudio para poder comparar los resultados.
Para los monocitos, una ampliación de 40 x funciona bien utilizando software de acceso gratuito como Image, NIH Image o Image Tool para determinar el área promedio de oro coloidal eliminado por 10 a 20 o más células para cada muestra a partir de las imágenes capturadas. Aquí se muestra el trayecto despejado de partículas de oro coloidal por un monocito no estimulado, tomado con un objetivo de 40 x. Las células no móviles crean rastros característicos pequeños, con forma ovalada o circular, alrededor de sí mismas, lo que indica un nivel bajo de movimiento. En contraste, las células altamente móviles se caracterizan por un movimiento direccional, formando rastros alargados y áreas totales más grandes debido a sus formas irregulares.
Los recorridos celulares se analizan mejor utilizando la herramienta de trazo libre en el software Image J para delinear su volumen. Luego, se pueden realizar mediciones cuantitativas del área utilizando la herramienta de medición en el menú de análisis de Image J. Al realizar este procedimiento, es importante recordar seguir estrictamente los volúmenes y temperaturas indicados en el protocolo, ya que las desviaciones pueden influir fuertemente en los resultados finales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear cubreobjetos recubiertos con gelatina, cómo preparar nanopartículas de oro y cubreobjetos recubiertos con nanopartículas de oro, y cómo monitorear y evaluar cuantitativamente el movimiento celular utilizando microscopía óptica.
No olvide que trabajar con soluciones hirviendo en una placa calefactora, especialmente los vapores procedentes de la solución hirviente de fluoro, ácido AIC y citrato sódico, puede ser peligroso; se deben tomar siempre precauciones como trabajar en la campana extractora y usar el sentido común durante la realización de este procedimiento.
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Resumen
El ensayo de huellas de motilidad fagocinética mide cuantitativamente el movimiento de las células a lo largo del tiempo. Este método utiliza cubreobjetos recubiertos con nanopartículas de oro para visualizar la motilidad celular mediante la formación de huellas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Motilidad celular
- Desarrollo de ensayos
- Aplicaciones de nanopartículas
Antecedentes
- El ensayo evalúa la quimocinesis, o movimiento celular aleatorio.
- Las nanopartículas de oro proporcionan un rastro visual del movimiento celular.
- Los cubreobjetos libres de endotoxinas son esenciales para obtener resultados precisos.
- El recubrimiento con gelatina favorece la adhesión de las nanopartículas de oro.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para medir cuantitativamente la motilidad celular.
- Utilizar nanopartículas de oro para visualizar el movimiento celular.
- Mejorar la comprensión del comportamiento celular en diversas condiciones.
Métodos Utilizados
- Preparación de cubreobjetos de vidrio recubiertos con gelatina.
- Creación de nanopartículas de oro mediante la reducción del ácido cloroáurico.
- Recubrimiento de cubreobjetos con solución de nanopartículas de oro.
- Colocación de células sobre cubreobjetos recubiertos para observar el movimiento.
Resultados principales
- Las células crean trayectorias medibles sobre superficies recubiertas de oro.
- El ensayo permite la observación de la motilidad celular aleatoria.
- Se pueden recopilar datos cuantitativos a lo largo del tiempo.
- Las nanopartículas de oro visualizan eficazmente el movimiento celular.
Conclusiones
- El ensayo de huellas de motilidad fagocinética es un método confiable para estudiar la motilidad celular.
- Las nanopartículas de oro mejoran la visualización de las trayectorias celulares.
- Este ensayo puede aplicarse a diversas áreas de investigación que involucran el movimiento celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El ensayo de motilidad por huellas fagocinéticas proporciona un método cuantitativo y rentable para evaluar la motilidad celular utilizando equipos de laboratorio estándar, abordando un cuello de botella clave en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano. Al permitir el análisis de alto rendimiento del movimiento celular sin sistemas de imagen costosos, facilita la criba rápida de compuestos o perturbaciones genéticas que afectan la motilidad. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en las etapas de validación de dianas y de identificación de compuestos activos al proporcionar datos fenotípicos reproducibles y mecanísticamente relevantes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con las vías de migración celular en la metástasis del cáncer, el tráfico de células inmunitarias y los modelos de cicatrización de heridas.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de dianas al cuantificar los cambios en la motilidad tras la inhibición génica o la inhibición farmacológica, reduciendo la ambigüedad mecanicista.
- Valor predictivo: Genera métricas cuantitativas y estadísticamente robustas de motilidad que ayudan en la selección de carteras y en las decisiones de continuar o descartar proyectos basadas en la reducción del riesgo fenotípico.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera mediciones estandarizadas y reproducibles del área de rastreo que sirven como lecturas cuantitativas para el desarrollo de ensayos y campañas de cribado de compuestos.
- Valor operativo: Utiliza software gratuito de análisis de imágenes y microscopía óptica convencional, lo que permite una implementación escalable y de bajo costo en diversos equipos de investigación.
- Preparación del ensayo: Compatible con diversos tipos celulares, incluyendo células cancerosas, fibroblastos, neutrófilos y monocitos, ampliando su aplicabilidad en múltiples áreas terapéuticas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta las observaciones de movilidad en fase de descubrimiento con la validación preclínica al proporcionar datos fenotípicos cuantitativos relevantes para la enfermedad.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Clarifica el papel de los reguladores del citoesqueleto y de la señalización de receptores en el movimiento celular, orientando la selección de dianas y la alineación de biomarcadores.
- Confianza Predictiva: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de fenotipos de motilidad in vitro con procesos fisiopatológicos como la invasión tumoral o la infiltración de células inmunitarias.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación de compuestos líder y la evaluación preclínica, ofreciendo una plataforma fenotípica reutilizable para procesos dependientes de la motilidad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la clarificación de vías al cuantificar la motilidad celular como un indicador funcional de perturbaciones genéticas o farmacológicas.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos y compatibilidad con alto rendimiento mediante el análisis cuantificable de trayectorias y requisitos mínimos de equipo.
- Análisis: Ofrece mediciones cuantitativas de áreas mediante herramientas de software gratuito, facilitando la comparación estadística entre condiciones y réplicas.
- Investigación Traslacional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar datos de motilidad relevantes para el desarrollo tisular, la vigilancia inmunitaria y el potencial metastásico.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad escalable y transversal a proyectos, en lugar de una técnica de uso único, maximizando el retorno de la inversión en reactivos y capacitación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de migración celular.
- Valor operativo: Garantiza estandarización, reproducibilidad y escalabilidad mediante una química sencilla, protocolos estandarizados y análisis de imágenes accesibles.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción, la eficiencia del capital y reduce el riesgo biológico en fases tardías mediante la identificación temprana de deficiencias relacionadas con la motilidad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y la toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en perfiles cuantitativos de motilidad impulsados por fenotipos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de nanopartículas coloidales y en técnicas estériles de cultivo celular para garantizar un recubrimiento consistente de nanopartículas de oro.
- Depende del acceso a microscopía óptica convencional, incubadoras y software de análisis de imágenes de acceso libre (por ejemplo, ImageJ) para la cuantificación de trayectorias.
- Necesita una estandarización entre equipos en la preparación de cubreobjetos, la densidad de siembra celular y los tiempos de incubación para asegurar la reproducibilidad entre laboratorios.
- Requiere adaptar la densidad de nanopartículas de oro y la duración de la incubación según el tamaño celular y las características de motilidad, para evitar efectos confusos derivados de un recubrimiento excesivo o insuficiente.
- Se limita a la evaluación de quimocinesis (motilidad aleatoria); los ensayos de migración dirigida pueden requerir métodos complementarios, como sistemas microfluídicos o basados en gradientes.
