Uso del ratón humanizado BLT como un modelo de células madre del tumor Terapia génica basada en

El objetivo general del siguiente experimento es generar ratones que porten un sistema inmunitario humano modificado. Esto se logra primero preparando al ratón para la cirugía y luego cargando el trócar con un fragmento de timo en el segundo paso. Se mezcla Matrigel con células transducidas negativas para CD34 y positivas para CD34, y la mezcla se añade posteriormente al trócar.

A continuación, los constructos de matrigel se trasplantan bajo la cápsula renal. En última instancia, el rechazo de los tumores diana por las células T CD8 modificadas genéticamente puede monitorizarse mediante imágenes por PET en vivo y mediciones físicas del tumor. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como los modelos completamente neuronales es que este método permite el estudio del desarrollo de células madre humanas modificadas genéticamente dentro del timo humano y la subsiguiente evaluación de la eficacia in vivo de las líneas derivadas. El procedimiento será realizado por tres técnicos de nuestros laboratorios: Gregory Bristol, Bernard Levin y Sean Kim.

En este diagrama esquemático, se describe el modelo BLT modificado utilizado en estos estudios para la generación de ratones quiméricos que portan mart, un tipo específico de linfocitos T. El implante tímico se reconstruye a partir de células CD34 transducidas y no transducidas aisladas de un hígado fetal autólogo. Una fracción de las células transducidas se congela y se inyecta en ratones irradiados cuatro a seis semanas después.

En este video, se muestra la implantación del constructo vivo una vez que los animales se han vuelto lentos debido a la anestesia. Comience afeitando el lado izquierdo de cada ratón desde la cadera hasta el hombro, entre el centro de la espalda y el vientre. Después de registrar el peso de cada animal, perfore sus orejas para numerarlos e inyecte subcutáneamente 0,3 mililitros de carprofeno en cada uno de sus hombros.

Luego coloque los ratones sobre su costado derecho mirando hacia la izquierda. Ahora lave el trocar de una aguja de implante de cáncer de calibre 16 con punta de lima redonda con PBS. Utilizando un par de pinzas de punta fina, agregue un trozo de timo al recipiente con PBS y luego sostenga el trocar en posición horizontal con la varilla.

Aspire el tejido justo dentro de la punta. Deslizar el trócar bajo la cápsula renal e inyectar el tejido es uno de los aspectos más difíciles de este procedimiento. A continuación, pida ayuda a un colaborador.

Utilice una pipeta de desplazamiento positivo de punta eend para mezclar cinco microlitros de matrigel frío en un tubo de células con agitación suave. Manteniendo el trocar en posición horizontal. Retire lentamente la varilla mientras el ayudante pipetea el matri gel.

Mezcle en el trócar para cada ratón. Primero, pase Betadine sobre la piel desnuda del animal y luego retírelo con una toallita de isopropanol. Localice en dos ocasiones el punto más oscuro bajo la piel, lo que indica la ubicación del bazo.

El riñón se encuentra aproximadamente cinco milímetros dorsal al bazo utilizando pinzas romas para levantar la piel sobre el riñón. Realice un corte de aproximadamente 15 milímetros de longitud en la piel paralelo al bazo. Haga un corte similar en la capa muscular del peritoneo debajo.

En los machos, el riñón debe ser directamente visible. Simplemente presione el abdomen para hacerlo sobresalir. Manteniendo presión sobre el abdomen con la mano izquierda para mantener el riñón expuesto, en las hembras primero use un hemostato para sujetar el ovario y luego arrastre el riñón hacia afuera para ayudar a mantener el órgano fuera del cuerpo.

Abra un pequeño orificio en el extremo posterior de la cápsula renal y luego deslice el trocar dentro de este orificio y a lo largo del riñón hasta que la abertura del trocar quede completamente cubierta por la cápsula renal. A continuación, utilizando el dedo meñique de la mano derecha, inyecte el tejido. Ahora utilice el hemostato cerrado para empujar suavemente el riñón de vuelta a su posición.

Amarre un punto en el peritoneo con un nudo doble, presionando la piel hacia arriba como una bolsa, y luego coloque dos grapas quirúrgicas. Finalmente, coloque una gota de PBS sobre cada ojo y coloque al ratón de lado en una jaula sobre un poco de aserrín. Después de implantar a todos los ratones de la misma manera, confirme que los animales hayan vuelto a acostarse sobre sus vientres antes de dejarlos.

Esta primera figura muestra una imagen representativa del implante vivo de TIM en ratones humanizados. En esta figura, se demuestra el desarrollo normal del tejido tímico y la distribución fisiológica del tejido de los linfocitos T positivos para CD cuatro y CD ocho humanos. Tras la reconstrucción, los animales poseen un sistema inmunitario humano con una distribución normal de linfocitos T positivos para CD cuatro y CD ocho.

Aquí se muestra una imagen representativa de un ratón que porta un tumor de melanoma. Las áreas grises indican la imagen de la tomografía computarizada (TC). Las áreas coloreadas indican la actividad metabólica del tumor detectada mediante la tomografía por emisión de positrones (TEP).

La tomografía computarizada por sí sola en este experimento indicó una gran masa tumoral en el área señalada por el círculo blanco. Sin embargo, como muestra la imagenología por PET in vivo, esta área consiste principalmente en tejido necrótico y cicatricial, lo que resalta la utilidad de la imagenología por PET como un método más sensible y preciso para evaluar la regresión y eliminación del tumor. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros ensayos, como fenotipificación de linfocitos T y activación ex vivo, para responder preguntas relacionadas con la función de los linfocitos T.