Heterotípicos tridimensional

El objetivo general del siguiente experimento es generar modelos tridimensionales típicos del desarrollo del cáncer de ovario en estadios iniciales. Primero, genere líneas celulares inmortalizadas H turt derivadas de tejidos epiteliales ováricos normales primarios y de fibroblastos. Luego, para recrear la arquitectura in vivo y las complejas interacciones célula-célula presentes en el ovario, realice un cultivo conjunto de líneas celulares epiteliales y estromales en modelos de esferoides tridimensionales, proceda a fijar y teñir los cultivos de organoides y analice la expresión de marcadores específicos con el fin de estudiar las características moleculares de las interacciones estromal-epiteliales.

Los resultados obtenidos muestran cómo las alteraciones en el compartimento de células estromales de modelos tridimensionales típicos pueden influir en el fenotipo de las células epiteliales cultivadas conjuntamente. Los modelos tridimensionales típicos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer ovárico, como explorar los orígenes de esta enfermedad y esclarecer el papel del microentorno estromal en la iniciación y el desarrollo tumoral. Las aplicaciones de estas técnicas se extienden hacia el diagnóstico y tratamiento de enfermedades en comparación con otros métodos de cultivo tridimensional.

Esta técnica puede aplicarse a un rango más amplio de volúmenes de cultivo celular y aplicaciones posteriores. Por ejemplo, los cultivos tridimensionales homotípicos pueden utilizarse para pruebas de fármacos in vitro. Este enfoque también puede aplicarse a otros sistemas modelo, como en el estudio de otros tipos de tumores sólidos o en enfermedades benignas.

Transporte el tejido ovárico fresco al laboratorio de cultivo celular en medio de crecimiento para fibroblastos ováricos normales inmortalizados, suplementado con antibióticos y antifúngicos adicionales. Lave la muestra tres veces con cinco mililitros de PBS para eliminar cualquier célula epitelial que permanezca débilmente adherida al tejido. A continuación, transfiera la muestra junto con el PBS a una placa de cultivo P 100 limpia. Utilizando instrumentos estériles, transfiera el tejido a una segunda placa de cultivo P 100 seca y limpia.

Corte el tejido en trozos de 0,5 centímetros cuadrados y transfiera cada trozo a una placa P 100 separada. Continúe cortando el tejido en trozos de menos de un milímetro cuadrado de tamaño. A continuación, agregue 20 mililitros de medio INOF GM y cultive. Monitoree el crecimiento celular utilizando microscopía de contraste de fases.

Confirme que las células se adhieran al recipiente en un plazo de 24 horas. Monitoree el crecimiento celular mediante microscopía de contraste de fase. Por lo general, las células se adhieren al recipiente en un plazo de 24 horas. Después de una semana, elimine cualquier tejido no adherente mediante aspiración, reponga el medio y, posteriormente, renueve los cultivos dos veces por semana durante uno a tres semanas, cuando las colonias celulares tengan aproximadamente 500 micrones de tamaño.

Aislar los clones utilizando triplicados y discos de clonación recubiertos. Con el fin de confirmar células fibroblásticas al 100 %, sembrar una muestra de la línea celular sobre cubreobjetos de vidrio y realizar tinción por inmunofluorescencia para un marcador fibroblástico, un marcador epitelial y un marcador de células endoteliales.

Un día antes de la transducción retroviral del pase H Turt, aísle los fibroblastos ováricos normales de un solo plato P 100 en tres platos P 100. El sobrenadante viral preelaborado se puede adquirir comercialmente o producirse internamente utilizando protocolos estándar de transfección conjunta de células HEC 2 9 3 T. Para preparar la solución de poli Hema, pese 1,5 gramos de poli Hema y colóquelos en un frasco estéril.

Añada 95 mililitros de etanol absoluto de grado para biología molecular y 5 mililitros de agua destilada de grado para cultivo celular. Coloque la solución de poli Hema en un baño de agua a 65 grados Celsius hasta que se disuelva completamente. Recubra las placas de cultivo de tejidos con la solución de poli Hema recién preparada.

Deje secar al aire los recipientes de cultivo celular dentro de la campana de flujo laminar. Se puede utilizar un movimiento suave de balanceo en una plataforma oscilante para asegurar un recubrimiento uniforme de los recipientes o matraces de mayor tamaño. Si la solución de poli-L-lisina se seca demasiado rápido, la superficie no será lisa.

Si se desea, tratar previamente los fibroblastos antes del cultivo en 3D; por ejemplo, para inducir la senescencia, tratar las células con dosis subletales de peróxido de hidrógeno. Recuperar y expandir los cultivos de INOF y de células epiteliales in vitro para obtener suficientes células para establecer esteroides heterotópicos en 3D. Después de un lavado con PBS de cinco minutos, añadir 15 mililitros de medio a la placa de poli hema.

Mientras tanto, añada tripsina a las células de fibroblastos ováricos normales inmortalizadas para separarlas del recipiente de cultivo. Después de tres a cinco minutos, neutralice la tripsina con un volumen igual de medio de cultivo y recupere las células mediante centrifugación. Re suspenda el sedimento celular en cinco mililitros de medio y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo o agitando suavemente en vórtex.

Luego, utilice una muestra de 10 microlitros para enumerar las células viables mediante tripan azul. Ahora agregue 4 millones de células INOF al medio ya dispensado en la placa recubierta con poli-hema. Complete el volumen del medio de cultivo hasta 20 mililitros e incube a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono.

Monitoree la agregación celular en esferoides multicelulares mediante microscopía de contraste de fase para reponer los cultivos de esferoides S cada dos o tres días. Coloque las placas en un ángulo sobre una pipeta. Permita que los esferoides sedimenten y retire cuidadosamente alrededor de 16 mililitros del medio agotado con una pipeta de cinco mililitros.

Añada 16 mililitros de medio fresco a la cultura y devuélvala al incubador el día siete. Cree cultivos heterotípicos añadiendo células epiteliales a los fibroblastos phe. Primero, prepare suspensiones de células epiteliales ováricas mediante tripsina como se describió anteriormente tras enumerar las células.

Lave una vez con medio GM INOF para evitar que se transfieran factores de crecimiento procedentes del medio de crecimiento epitelial. Después de reponer el medio de las cultivos de OID de fibroblastos, agregue las células epiteliales en una proporción de cuatro a uno, fibroblastos a células epiteliales. Los OID heterotópicos en medio GM INOF requieren recambio de medio típicamente cada dos o tres días durante 14 días adicionales.

Para la inmunohistoquímica, fije el EFP con formalina tamponada neutra, haga un pellet del EFP y sustituya la formalina con etanol al 70 %. Proceda a procesar en parafina utilizando protocolos estándar empleados para tejidos humanos. Los esteroides incluidos en parafina pueden seccionarse y teñirse con hematoxilina y eosina o con marcadores moleculares específicos mediante inmunohistoquímica.

Alternativamente, lave los esteroides en PBS y fíjelos en paraformaldehído al 4%. Luego incluya las muestras en medio OCT y congele rápidamente para seccionado en criostato y tinción inmunofluorescente para su análisis mediante citometría de flujo. Lave los esteroides en PBS y disocie mediante digestión con tripsina o Accutase a 37 grados Celsius.

La disociación completa de esteroides en una suspensión de células individuales puede favorecerse pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de un mililitro. Tenga cuidado de no romper las células en exceso, neutralice la reacción con un volumen igual de medio de cultivo y elimine los agregados celulares pasando la suspensión a través de un filtro celular de 40 a 70 micrones. Luego, pelete las células, lávelas con PBS, cuéntelas, resuspenda el número deseado de células en tampón facts y tiña según las instrucciones del fabricante. En nuestro laboratorio, hemos transformado parcialmente células epiteliales ováricas y cultivado conjuntamente estas células con fibroblastos ováricos normales y senescentes para imitar el desarrollo del cáncer ovárico en estadios tempranos.

En un ovario premenopáusico, la tinción inmunofluorescente de fibroblastos ováricos normales inmortalizados h hert muestra que tanto los fibroblastos ováricos normales primarios como los fibroblastos ováricos normales inmortalizados expresan la proteína específica de fibroblastos, pero no expresan citokeratina siete ni menton. Las células de fibroblastos ováricos normales cultivadas solas en 3D sobre PHE presentan una morfología alargada y una matriz extracelular abundante. Aquí, los fibroblastos ováricos normales fueron expuestos a peróxido de hidrógeno para inducir senescencia durante siete días y luego cultivados con células epiteliales ováricas parcialmente transformadas durante 14 días.

Para distinguir los dos tipos celulares, los esteroides resultantes se tiñeron inmunológicamente para mim-1 como marcador de proliferación y para pan-citoqueratina como marcador epitelial. La cuantificación de los datos sugiere que el microentorno envejecido promueve características neoplásicas de células epiteliales parcialmente transformadas, mientras que un microentorno normal inhibe la progresión neoplásica; se restauran características histológicas de células normales y malignas que no son detectables cuando las células se cultivan como monocapas. Cuando las células pasan a un cultivo en esferoides, por ejemplo, pueden detectarse características histológicas de los cánceres ováricos de células claras en cultivos tridimensionales de líneas celulares de cáncer ovárico de células claras, pero no en cultivos de monocapa de las mismas células.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer cultivos tridimensionales típicos para estudiar las interacciones entre células epiteliales y estromales durante la etapa temprana de la génesis tumoral. Al establecer un cultivo 3D, es importante ajustar el número de células según la aplicación posterior, permitiendo cierta pérdida de material durante el procesamiento.

Una vez dominado, el cultivo tridimensional puede establecerse en una hora siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la citometría de flujo combinada con el perfilado de expresión génica mediante micromatrices, pueden realizarse para analizar los cambios globales en la expresión génica que ocurren en cultivos tridimensionales típicos, pero que no se detectan bajo condiciones de cultivo en monocapa. Esto permitirá el análisis de las vías de señalización bidireccionales que ocurren específicamente en un microentorno de cultivo tridimensional.