Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

El objetivo general del experimento mostrado en este video es evaluar si el péptido antimicrobiano lyin desempeña un papel en la mejora de la colitis inducida por sulfato de dextrano en ratones. Esto se logra inyectando médula ósea de ratones de tipo silvestre en ratones licit y knockout irradiados, y médula ósea de ratones knockout en ratones de tipo silvestre irradiados. La médula ósea trasplantada generará nuevas células sanguíneas en el receptor con el genotipo del donante.

A los ratones receptores se les expone a sulfato de dextrano para inducir colitis después de cuatro semanas. El trasplante exitoso se valida mediante citometría de flujo y el daño del tejido colónico se evalúa mediante histología. Se obtienen resultados que muestran que la colitis se mitiga cuando se trasplanta médula ósea de tipo silvestre a ratones knockout.

Por el contrario, la colitis empeora cuando se trasplanta médula ósea knockout a ratones de tipo salvaje. Este método puede ayudar a responder preguntas clave para determinar las expresiones génicas de células derivadas de la médula ósea o de células no derivadas de la médula ósea en procesos inflamatorios o infecciosos. Se recomiendan ratones C 57, black six, de tipo salvaje y ratones knockout C elicited para este experimento, con el fin de poder rastrear los ratones de tipo salvaje y los ratones knockout.

Células donantes tras el trasplante de médula ósea. Utilice ratones CD45.1 para representar ratones de tipo salvaje y CD45.2 para los ratones knockout. El gráfico mostrado aquí describe el diseño experimental: cinco ratones donantes y diez ratones receptores se asignan a cada grupo.

Para los grupos A y B, se trasplantará médula ósea de ratones de tipo salvaje a ratones knockout. Se inducirá colitis en el grupo A, pero no en el grupo B. Para los grupos C y D, se trasplantará médula ósea de ratones knockout a ratones de tipo salvaje, y se inducirá colitis únicamente en el grupo C. Para los grupos E y F, el trasplante será de tipo salvaje a tipo salvaje, y para los grupos G y H, el trasplante será de knockout a knockout. Para preparar la médula ósea donante para su transferencia a ratones irradiados, comience por extraer la médula ósea de los huesos de ratones sacrificados en una cabina de seguridad biológica.

Utilice instrumentos de disección estériles para exponer los huesos del húmero, fémur, tibia y peroné, libres de músculos y ligamentos adyacentes, y transfiéralos a una placa de Petri. Corte ambos extremos de los huesos para mostrar la médula ósea roja. Luego, sujete uno de los huesos con pinzas.

Extraiga la médula ósea roja con PBS frío utilizando una jeringa de tres mililitros y agujas de calibre 25 hacia otro recipiente de Petri. Luego, lave el hueso desde el otro extremo para obtener más células de la médula ósea. Repita este proceso con cada uno de los huesos.

Reúna por separado la médula ósea de ratones de tipo silvestre y ratones knock out. Utilice una jeringa de seis mililitros con una aguja de 18 gauge y media pulgada para romper los coágulos de médula ósea roja mediante aspiraciones y expulsiones repetidas. Luego, use una pipeta serológica para transferir la médula ósea recolectada a un tubo cónico de 50 mililitros.

Una vez que se haya transferido toda la médula ósea, centrifugar la médula ósea a 740 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado mediante vortex durante cinco a 10 segundos. Al precipitado, agregar cinco mililitros de tampón de lisis de ERX por ratón donador, volver a vortex durante cinco segundos e incubar exactamente durante tres minutos a temperatura ambiente.

Después de tres minutos, agregue 20 mililitros de PBS frío a cada tubo y mezcle por inversión para detener la lisis. Luego, vierta el contenido a través de un filtro celular de 40 micrones en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el tubo original con cinco mililitros de PBS y transfiera la solución al filtro celular.

Continúe recolectando el flujo que atraviesa en el tubo cónico. Luego, aforar el volumen hasta 50 mililitros con PBS y mezclar por inversión. A continuación, determinar el recuento de células viables mediante exclusión con azul de tripan utilizando un hemocitómetro.

Una vez determinado el recuento celular, centrifugar las células de médula ósea a 913 ×g durante cinco minutos a cuatro grados celsius. Tras la centrifugación, eliminar el sobrenadante según el recuento total de células. Suspender nuevamente el precipitado en PBS a una concentración de 1 × 10⁸ células por mililitro.

Las células de médula ósea ya están listas para ser transferidas a ratones receptores irradiados. Los ratones receptores de tipo silvestre y knockout para este experimento han sido irradiados con 1000 rad como se describe en el documento adjunto; los ratones se crían y mantienen en una instalación libre de patógenos. De cuatro a 24 horas después de la irradiación, caliente los ratones receptores sobre una almohadilla térmica bajo una lámpara de calor para inyectarles la médula ósea donante. Coloque un ratón receptor en un dispositivo de inmovilización, limpie la cola con etanol al 70 % para esterilizar el sitio de inyección y promover la vasodilatación local que facilite la inyección.

Utilizando una jeringa de insulina con una aguja de calibre 28 y medio, inyecte una vez 10 a la séptima células en uno a 200 microlitros en la vena de la cola de cada ratón tras la inyección. Coloque el ratón en una jaula con hasta otros tres ratones inyectados durante las primeras cuatro semanas tras la inyección. Mantenga a los ratones receptores inyectados en jaulas autoclavadas con agua que contenga el antibiótico sulfa trim.

Esto permite tiempo para que los animales recuperen la inmunidad, cambien las jaulas y se administren agua y alimento tratados con antibióticos cada cuatro días para mantener la higiene. Cuatro semanas después de la irradiación y el trasplante de médula ósea, cambie al agua normal sin antibióticos y mantenga a los ratones durante otras dos semanas para que recuperen su microbiota intestinal normal. Seis semanas después de la inyección de médula ósea, mida el peso corporal inicial para inducir la colitis.

Administre a los ratones del grupo experimental de colitis 5 % de dextrano sulfato en el agua de bebida. Cinco días después, reúna la sangre periférica de cuatro ratones en tubos vacutainer recubiertos con heparina y colóquelos en hielo. Luego, en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, combine 300 microlitros de sangre con 300 microlitros de tampón para tinción celular y alícuote la sangre en cinco tubos de citometría de flujo etiquetados del uno al cinco, cada uno con 100 microlitros sobre hielo.

Después de sacrificar los ratones, mida nuevamente el peso corporal y calcule el cambio. Diseque los tejidos del colon y colóquelos en formalina para tinción con H y E. Luego obtenga las células de la médula ósea como antes.

Divida la médula ósea resuspendida en cinco tubos de microcentrífuga etiquetados del uno al cinco, cada uno con 100 mililitros. En preparación para el análisis mediante citometría de flujo, prepare la mezcla de anticuerpos para cada tubo respectivo en la oscuridad, como se describe en el documento adjunto; las muestras de sangre y médula ósea etiquetadas con el número uno servirán como controles y no serán teñidas. Las muestras de sangre y médula ósea etiquetadas con el número dos serán teñidas con el control de isotipo FITC, el control de isotipo PE y la solución bloqueadora CD16/32.

Estos controles de isotipo se utilizan para confirmar la especificidad de la unión del anticuerpo primario a las muestras. La muestra etiquetada con el número tres será teñida con FZ CD 45.1 y CD 16/32. Las muestras con solución bloqueante etiquetadas con el número cuatro serán teñidas con CD 45.2 y CD 16/32.

Solución de bloqueo. La marcación con un solo color puede revelar la presencia de células donantes o receptoras en la sangre o en la médula ósea. Evidentemente, las muestras etiquetadas con el número cinco se tiñen para CD 45.1, CD 45.2 y CD 16/32.

El bloqueo aquí permite que la marcación bicolor muestre la proporción relativa de células donantes y receptoras en sangre o médula ósea. Añada cinco microlitros de la mezcla de anticuerpos dos y cinco a sus respectivos tubos de muestra. Luego, añada tres microlitros de la mezcla de anticuerpos tres y cuatro a sus respectivos tubos de muestra.

Incube todos los tubos en hielo durante 30 minutos. Tras la incubación, agregue dos mililitros de tampón de lisis XRBC a cada tubo. Luego, incube las muestras durante otros 15 minutos en hielo y en la oscuridad.

Centrifugar las células a 350 ×g durante cinco minutos a cuatro grados celsius. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento con 500 µL de tampón de tinción celular en la oscuridad. Luego, vortexear brevemente.

A continuación, realice citometría de flujo en las muestras de sangre y médula ósea inmunomarcadas. Seleccione FZ para representar el tipo salvaje CD 45.1 y PE para representar el CD 45.2 nulo. Analice los resultados de la citometría de flujo utilizando el software de Flo Joe.

Calcule la relación de ajuste de E a relación PE o relación de PE a ajuste de e para determinar si el genotipo del donante es un genotipo dominante en sangre y médula ósea. Esta imagen muestra imágenes de muestra de h y e de colon con histología normal y colitis por DSS. Las imágenes de histología se puntúan según el daño del tejido mucoso y la infiltración de neutrófilos en los tejidos mucosos y submucosos.

Por lo tanto, un puntaje histológico más alto indica una colitis más severa para evaluar si la lisina desempeña un papel en la prevención de la colitis. Se intercambió la médula ósea entre ratones de tipo silvestre y ratones knockout como se describe en este video. Luego, se evaluó y puntuó la histología como se muestra aquí.

Los puntajes de histología aumentaron significativamente cuando se introdujo médula ósea de ratones knockout en ratones salvajes irradiados. Por el contrario, los puntajes disminuyeron significativamente cuando se introdujo médula ósea de ratones salvajes en ratones knockout. Estos datos indican que la proteína C endógena procedente de células derivadas de la médula ósea tiene efectos antiinflamatorios y mejora la colitis, lo que verifica que el trasplante fue exitoso en estos ratones.

Se realizó citometría de flujo también en médula ósea y sangre de los ratones tras el trasplante. La médula ósea de tipo salvaje se tiñe intensamente para Fitz CD 45.1, pero no para pe, CD 45.2 como se muestra aquí; la médula ósea knockout se tiñe intensamente para PE, pero no para Fitz, como se muestra aquí. Sin embargo, tras el trasplante, tanto la médula ósea como la sangre de ratones de tipo salvaje que recibieron médula ósea knockout mostraron tinción intensa para PE, pero no para Fitz, lo que indica que la población predominante de células teñidas provenía del donante.

Asimismo, la médula ósea y la sangre de ratones knockout que recibieron médula ósea de tipo silvestre se tiñeron intensamente para fitzy pero no para pe, confirmando nuevamente que las poblaciones predominantemente teñidas eran de origen donante. Después de ver este video, usted debería ser capaz de realizar un experimento de trasplante de médula ósea y debería ser capaz de modificar la colitis mediante células derivadas de la médula ósea.