La visualización de las respuestas inducidas por toxinas bacterianas mediante microscopía de fluorescencia de células en vivo

El objetivo de este procedimiento es visualizar las respuestas de las células inmunitarias a las toxinas bacterianas. Primero, la toxina se expresa y se purifica a partir de células BL 21 gold. Una vez confirmada la actividad y concentración de la toxina, esta se administra a células inmunitarias.

Se realiza microinyección y microscopía en vivo de células a alta velocidad. El análisis de las imágenes resultantes revela la cinética en tiempo real de las respuestas de las células inmunitarias a la toxina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como el mecanismo de activación del inflamasoma.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las respuestas de las células inmunitarias mediadas por toxinas, también puede aplicarse a otros estímulos, incluidos los atractantes quimiotácticos. Tuvimos por primera vez la idea de este método al estudiar la interacción entre bacterias y células inmunitarias cultivadas, y observamos interacciones altamente variables entre las bacterias y las células inmunitarias. Comience la purificación de estreptolisina O o SLO con un cultivo de células BL 21 gold que contenga PAG tres SLO.

El plásmido creció hasta alcanzar una DO de aproximadamente 0,6. Para inducir la expresión proteica, agregue cinco mililitros de 20% de OSes al cultivo y agite a 225 rpm a temperatura ambiente durante tres horas. A continuación, transfiera las bacterias a un frasco de centrífuga de 500 mililitros.

Luego, centrifugue el cultivo a 12.000 × g durante 12 minutos a cuatro grados Celsius; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante. Invierta el tubo y almacene el precipitado a menos 80 grados Celsius durante la noche o más tiempo si es necesario. Para purificar la SLO expresada, agregue 10 mililitros de tampón de lavado ly suplementado con Triton X-100, lisozima y fluoruro de fenil metilsulfonilo al precipitado congelado e invierta la pipeta arriba y abajo durante aproximadamente 15 minutos.

Para resuspender, suspenda el precipitado manteniendo la muestra en hielo. Transfiera el precipitado resuspendido a un tubo de polipropileno redondo de fondo tipo Oak Ridge de 50 mililitros. Somete el lisado a sonicación utilizando una sonda ultrasónica al 40 % de potencia, cinco veces durante 30 segundos cada una, con intervalos de 30 segundos y 30 segundos en hielo entre cada ciclo.

Luego, centrifugue el lisado sonicado a 39.000 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, añada el sobrenadante bacteriano a un mililitro de resina lavada de níquel NTA agarosa. Incube la resina de níquel NTA agarosa y el lisado juntos durante 2,5 horas a cuatro grados Celsius con agitación suave tras la incubación.

Centrifugue las perlas a 400 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Tenga en cuenta que todos los lavados y elución posteriores se realizan con estas condiciones de centrifugación, salvo que se indique lo contrario. Tras la centrifugación.

Combine 30 microlitros del sobrenadante con 10 microlitros de tampón de muestra SDS cuatro veces en un tubo de microcentrífuga y guárdelo en hielo para el análisis de pureza. A continuación, deseche el resto del agente sobrenadante y lave las perlas cuatro veces con tampón de lavado para piojos. Y una vez con tampón de sal interesante, centrifugando entre cada lavado. A partir de este momento, asegúrese de mantener la muestra siempre en hielo.

La SLO es una proteína muy sensible al estado redox y perderá rápidamente su actividad si se calienta a 37 grados centígrados, incluso si es por un período corto de tiempo. Para eluir la proteína SLO, agregue un mililitro de tampón de elución y cinco microlitros de DTT uno molar a las perlas, incube en hielo durante 10 minutos. Luego, centrifugue y recoja el sobrenadante en un tubo de centrífuga etiquetado con el número de elución.

Repita este proceso tres veces y luego, para agotar el endotoxina del proteína SLO, agregue 200 microlitros de perlas de agaroza conjugadas lavadas, suspendidas en tampón salino res, a la muestra y agite a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Luego centrifugue a 10.000 ×g durante un minuto a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, recoja el sobrenadante en nuevos tubos microcentrífugos etiquetados.

Combine 30 microlitros de cada elución con 10 microlitros de tampón muestral SDS cuatro veces. Para el análisis por SDS-PAGE, mantenga las soluciones de SLO en hielo. Determine las concentraciones de proteína y la actividad hemolítica; si son satisfactorias, recupere el SLOE en cuartos de cinco a 10 microlitros, luego congele en hielo seco y almacene a menos 80 grados Celsius.

Luego determine la lisis específica. Reese. Suspenda las células que se van a probar a dos tiempos. Centre seis células por mililitro en tampón RB con 20 microgramos por mililitro.

Yoduro de propidio. Aquí se analizan las células T 27 A. Añada 100 microlitros de células a cada pocillo de una placa de fondo en V de 96 pocillos en tubos separados de microcentrífuga.

Diluya seriamente el SLO hasta dos veces la concentración final en el tampón rb. Luego, agregue 100 microlitros de toxina o 100 microlitros de tampón RB a las células e incube durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Las concentraciones finales típicas varían desde 2000 unidades por mililitro hasta 31,25 unidades por mililitro.

Analice las células en un citómetro de flujo y recopile datos con filtros para fi, cethrin o pe. Un desplazamiento de un logaritmo representa células transitoriamente permeables, mientras que un desplazamiento de tres logaritmos indica células muertas. Calcule la lisis específica de las células restando el porcentaje de células muertas en el control del valor experimental utilizando la ecuación mostrada aquí un día antes de sembrar los experimentos, centre dos veces los cinco macrófagos sobre vidrio recubierto con colágeno.

Placas de 35 milímetros. El microscopio utilizado para la administración de toxinas debe estar equipado con una platina invertida, una platina calefaccionada, los cubos de filtros de excitación y emisión apropiados, y, si está disponible, una lente de Bertrand. La parte más difícil de este procedimiento consiste en introducir la aguja intacta hasta las células.

Para garantizar el éxito, utilizamos una lente de Bertrand, que normalmente se emplea para la alineación, con el fin de visualizar la aguja mientras la pasamos a través de los planos focales. El microscopio debe estar conectado a un microinyector y debe controlarse mediante una computadora con suficiente memoria para recopilar y almacenar datos, encender el microscopio y el microinyector, y permitir que la platina calefactora alcance 37 grados Celsius mientras se espera que se caliente. Incube las células durante 30 minutos con el colorante a 37 grados Celsius.

Según el ensayo, la marcación se puede realizar con cinco microlitros, cuatro o 2:00 AM en un mililitro de HBSS o dos microlitros de calcio am en un mililitro de medio completo; aquí se utiliza cuatro o dos. Retire el medio celular y lave las células una vez con PBS. Aspire el PBS y sustitúyalo con un mililitro de RPMI suplementado con dos milimolares de cloruro de calcio.

Monte el cultivo en el microscopio, enfoque las células con campo claro y luego ajuste para enfocar ligeramente por encima de las células. A continuación, combine un microlitro de toxina SLO con cuatro microlitros de DEXTRA 5 55 al 10 miligramos por mililitro y seis microlitros de agua. Luego, centrifugue a 20.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Se utiliza dextrano para verificar que la punta femto no esté obstruida por G. Utilice un cargador micro para introducir dos microlitros de toxina diluida en la punta femto desde la parte trasera. Coloque la punta femto en el microinyector.

Luego, ajuste el ángulo del inyector de modo que la punta quede centrada sobre las células, con espacio suficiente para moverse en todas las direcciones; borre la configuración anterior del límite Z, que restringe cuán bajo puede llegar la punta del microinyector. Configure el microinyector para que inyecte durante 0,5 segundos a 120 PSI con una presión de retroceso de 20 PSI. A continuación, baje la punta hasta que entre en el medio.

Usando la lente de Bertrand. Centre la punta y siga la punta mientras se baja hacia las células. Una vez que la aguja salga del enfoque, cambie nuevamente a la óptica normal.

La sombra de la aguja debe ser visible en el campo. Enfocar por encima de las células y bajar la aguja hasta que entre en foco. Luego, enfocar las células y acercar cuidadosamente la aguja junto a una célula.

Después de establecer el límite Z para la inyección, comience la adquisición de imágenes e inyecte la toxina. Luego eleve la aguja y muévase a una nueva región de células. Inyecte toxina adicional y continúe la adquisición de imágenes tras la inyección.

Mueva la aguja a la posición inicial para evitar cualquier fuga no deseada de toxina de la aguja mediante el método descrito en este video, 10 a la siete a 10 a la ocho unidades por mililitro. SLO se obtiene típicamente con una concentración de proteína de cuatro miligramos por mililitro. Esta electroforesis en gel SDS muestra muestras bacterianas antes y después de la inducción de la toxina tras la purificación, y cada una de las tres tinciones con azul de Coomassie revela que la SLO inducida fue purificada con éxito.

SLO es la banda de 69 kilodalton para determinar la cantidad de toxina necesaria para la lisis de células T 27 A o D dos. Las células fueron expuestas a diversas concentraciones de SLO durante cinco minutos a 37 grados Celsius en presencia de yoduro de propidio y analizadas mediante citometría de flujo. La lisis específica se determinó como se muestra aquí.

250 unidades por mililitro. SLO produce una lisis al 50 % en ambas células T 27 A y D. Una dosis sublítica del 10 % de lisis del toxina sería de 62,5 unidades por mililitro.

Estos valores son importantes para establecer una actividad de referencia de la toxina y evaluar la muerte celular tras la exposición a la toxina. Los fibroblastos dérmicos humanos se incubaron con calcio y homodímero de atherium utilizando un kit de viabilidad celular de Life Technologies. Tras la exposición localizada a la toxina bacteriana, antrolisina O. En esta imagen, el calcio se muestra en verde y el bromuro de atherium en rojo; las regiones cercanas al microbioma muestran muerte celular caracterizada por la pérdida de calcio y la absorción del homodímero de athe, mientras que las regiones más alejadas de la punta no mostrarán daño alguno.

La microentrega de la toxina también permite el examen de eventos en tiempo real, como el flujo de calcio. Estas DCs humanas cargadas con 4:02 AM fueron expuestas a SLO a un caudal constante con una adquisición simultánea de imágenes en vivo que cambia de verde a azul. El pseudocolor indica un aumento en los niveles de calcio citosólico.

SLO induce un rápido aumento en el calcio citosólico, que se propaga a través de la región del recipiente debido a la administración localizada. Sin embargo, solo las células cercanas a la punta del microinyector encuentran y reaccionan con la toxina. Esto demuestra tanto la reacción celular a la toxina como el área espacialmente restringida de administración de la toxina para resolver eventos en la dimensión zdi.

La microentrega se combinó con microscopía confocal 3D de alta velocidad. Este conjunto de imágenes muestra células dendríticas tras la inyección de toxina. Fueron preincubadas con anticuerpo anti CD11c conjugado con PC, mostrado en verde, para marcar la membrana plasmática.

Como puede observarse aquí, se liberan microvesículas tras la administración de la toxina. Como parte del proceso de reparación celular, las moléculas de toxina se concentran en blebs, los cuales se desprenden para eliminar la toxina. Una vez dominado, el microscopio puede realizarse en 45 minutos.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener la toxina fría antes de mezclarla con las células y probar su actividad hemolítica. Bien. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la cinética en tiempo real de las respuestas de las células inmunitarias a toxinas bacterianas utilizando microscopía de células vivas.