Un dispositivo de microfluidos para el estudio de varias cepas distintas

El objetivo general del siguiente método es obtener imágenes del comportamiento de células individuales de diferentes cepas de levadura bajo las mismas condiciones dinámicas. Esto se logra fabricando un dispositivo microfluídico de dos capas, en el que la capa inferior contendrá por separado cada una de las diferentes cepas, y la capa superior proporcionará las condiciones de flujo dinámico en un segundo paso. Diferentes cepas de levadura se colocan en los pozos y el dispositivo se cierra, creando un canal único con múltiples cepas separadas.

A continuación, observamos las respuestas celulares a cambios dinámicos del medio. Al controlar los caudales en las dos entradas del canal en Y, los resultados muestran diferentes cepas sometidas a las mismas condiciones dinámicas y sin contaminación cruzada entre pozos. Este dispositivo de microfluídica presenta varias ventajas clave frente a otros sistemas existentes. Permite observar múltiples cepas distintas bajo las mismas condiciones dinámicas.

Además, es importante destacar que puede fabricarse fácilmente en cualquier laboratorio sin necesidad de equipo especial. La idea de este método surgió de una discusión sobre cómo seguir las respuestas de diferentes aislamientos silvestres del este a períodos de inanición. Comience, dibuje o imprima el diseño deseado de los microcanales a escala.

A continuación, cubra un portaobjetos de vidrio con capas de cinta adhesiva. Para alcanzar la altura deseada del canal, coloque el diseño del molde sobre una superficie plana y alinee el portaobjetos sobre el patrón del diseño. Ahora corte cuidadosamente la cinta adhesiva del portaobjetos de vidrio según el diseño. Retire la cinta adhesiva de todas las regiones del portaobjetos de vidrio.

Acepte aquellos en la disposición del microcanal. Coloque el portaobjetos en una estufa de calentamiento a 65 grados Celsius durante tres minutos. Luego limpie suavemente con etanol.

Mezcle los componentes base y de curado del PDMS según lo recomendado por el fabricante. Vierta aproximadamente 30 mililitros de la mezcla de PDMS en una placa de Petri hasta una altura de aproximadamente 0,5 centímetros. Desgasifique el PDMS al vacío si es necesario.

Sumerja la lámina de vidrio en el PDMS con la cinta adhesiva grabada hacia arriba. Colocar el patrón después del PDMS evita la formación de burbujas de aire entre la lámina y el fondo del recipiente. Cure durante 48 horas a 65 grados Celsius, asegurándose de que el recipiente esté horizontal utilizando un nivel de burbuja en un nuevo plato de Petri de 90 milímetros. Vierta tres mililitros de mezcla de PDMS.

Este paso puede realizarse en un spin coder si está disponible. DGAs y curado como se mostró anteriormente. Ahora, corte suavemente la capa de flujo del dispositivo microfluídico al tamaño deseado con un punzón de biopsia.

Cree orificios para las entradas y salidas en la capa de flujo. También corte una capa de pozos de tamaño similar del segundo plato de Petri y colóquela sobre un vidrio grueso. Deslice sobre el diseño del plano.

Luego, realice perforaciones para los pocillos alineadas con los microcanales del diseño utilizando etanol, limpie ambas capas de PDMS y una cubreobjetos de vidrio y séquelas al aire. A continuación, trate la cubreobjetos de vidrio y la capa de PDMS de los pocillos con un grabador de plasma estándar para unión no reversible o con un aparato manual de tratamiento por corona para unión reversible. Coloque cuidadosamente la capa de los pocillos encima de la cubreobjetos para provocar la adhesión.

Frotar suavemente para eliminar cualquier burbuja de aire. Preparar el medio deseado en jeringas adecuadas y conectarlas al tubo tigón insertado en una bomba de jeringa. Para la obtención de imágenes celulares.

Utilice las fortalezas. Diríjase a la fase deseada, vortexe bien la cultura y transfiera 300 microlitros a tubos de microcentrífuga. Coloque suavemente un microlitro de con canna A en cada pocillo de la capa de pocillos de PDMS.

Lave el exceso de conna A de cada pocillo dos veces pipeteando agua suavemente mientras el con en A se seca. Lave las cepas dos veces con 300 microlitros de medio SC sin glucosa. Eliminar la glucosa residual de las paredes celulares ayuda a una adecuada adherencia al conval.

Después de agitar en vórtex, pipetee cuidadosamente aproximadamente 0,5 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo individual. Lave suavemente las células residuales con medio rico. Los dos siguientes pasos deben realizarse rápidamente para evitar que las células se sequen.

Como paso opcional, trate el chip y los pocillos teniendo cuidado de no impactar directamente en los pocillos. Luego, bajo un estereoscopio, coloque cuidadosamente el chip sobre los pocillos prestando especial atención al alineamiento entre ambos. Presione suavemente para adherir las dos capas de PDMS.

Llene lentamente el dispositivo completamente con unos 50 microlitros de medio rico, asegurándose de que no queden burbujas de aire dentro del canal. Ahora conecte el dispositivo insertando los tubos en las entradas adecuadas e inicie el flujo del medio. Tenga cuidado de que no se formen burbujas de aire en los tubos, ya que estas pueden quedar atrapadas en el dispositivo y alterar el flujo.

Proceda a colocar el dispositivo bajo un microscopio y localice puntos adecuados para la adquisición de imágenes en cada uno. Mantenga las células bajo un flujo abundante de medio durante una hora o más, si es necesario, para permitir la recuperación.

Inicie el experimento con un flujo constante. Configure la bomba A a 0,8 mililitros por hora y la bomba B a 0,2 mililitros por hora. Para el medio a, el flujo debe cubrir el 80 % del ancho del canal.

Podemos cambiar dinámicamente las condiciones en el dispositivo modificando las tasas de flujo relativas. Las nuevas condiciones se estabilizan en cuestión de segundos a lo largo de todo el canal. Para demostrar la separación entre diferentes cepas, se obtienen imágenes de dos cepas de levadura distinguibles en pozos alternos.

Téngase en cuenta que no hay fuga celular entre pozos en este experimento. Ambas cepas tienen el factor de transcripción MSN dos marcado con YFP para probar el efecto simultáneo de condiciones cambiantes dinámicamente. Las tasas de flujo en los dos canales de entrada se modificaron para crear un escalón de medio sin glucosa.

Esto resultó en la localización de MSN dos en el núcleo. Importante, se puede analizar la pista temporal de los niveles de MSN dos YFP en el núcleo en células individuales. Por lo tanto, el dispositivo microfluídico de PDMS puede utilizarse para aplicar condiciones dinámicas simultáneas a múltiples pocillos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar no dejar que las células se sequen durante el ensamblaje del dispositivo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse fácilmente sin necesidad de litografía suave.