El examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo

El objetivo general del siguiente experimento es examinar el desarrollo tímico en ratones mediante citometría de flujo. Esto se logra preparando suspensiones de células individuales a partir del timo y el bazo del ratón. Como segundo paso, los timocitos y linfocitos se tiñen con un cóctel de anticuerpos para la identificación de poblaciones tímicas específicas.

Finalmente, la frecuencia y el número de diversas poblaciones de linfocitos pueden evaluarse mediante análisis citométrico de flujo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo de linfocitos T, como qué genes y vías son importantes para generar un repertorio de células T funcional pero tolerante a las células propias. Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo de células T en el timo, también puede aplicarse en el estudio del desarrollo de otras células inmunitarias.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para diseñar sus cócteles de anticuerpos para citometría de flujo. Antes de comenzar la disección, coloque una malla de acero estéril en una placa de Petri de 60 por 15 milímetros. A continuación, agregue cinco mililitros de HBSS a la placa y coloque la placa en hielo para la recolección del timo.

Primero, utilice un par de pinzas para levantar la punta inferior del esternón y revelar el diafragma. A continuación, evitando el hígado, corte el diafragma para separar la caja torácica y luego corte la caja torácica en dirección ascendente por cada lado. Tenga cuidado de no dañar los pulmones y el corazón.

Ahora use la pinza para tirar suavemente hacia atrás de la caja torácica. El timo es un órgano blanco con dos lóbulos ubicado por encima del corazón. Utilice el borde plano de la pinza para sujetar la parte inferior de los lóbulos.

Luego, extraiga suavemente el timo y colóquelo sobre una de las mallas previamente preparadas. Para obtener el bazo, realice una incisión a través del peritoneo para exponer la cavidad abdominal. El bazo es un órgano rojo con forma de tabla de surf ubicado en el lado izquierdo de la cavidad abdominal del ratón, debajo del hígado.

Luego, use un par de pinzas para extraer el bazo y otro par para separar el tejido conectivo. A continuación, coloque el bazo diseccionado sobre una malla separada. Ahora, utilice el émbolo de una jeringa de tres mililitros para triturar cada órgano contra la malla hasta que solo queden tejido conectivo y grasa; aspire las células y el HBSS, y transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros.

Luego, lave cada malla con HBS fresco S3 tres veces. A continuación, centrifugue las células durante cinco minutos a 335 ×g y 4 grados Celsius. Después de aspirar el sobrenadante resus, suspenda los citos en 500 microlitros de un tampón de lisis CK durante 10 minutos a temperatura ambiente, mientras los glóbulos rojos esplénicos están siendo lisados Resus.

Suspenda los timocitos a 20 × 10⁶ células por mililitro en tampón fax y colóquelos sobre hielo. Ahora agregue cinco mililitros de HBSS para restablecer la isotonicidad después de centrifugar nuevamente las células; resuspenda el sedimento libre de GR a 20 × 10⁶ células por mililitro en tampón fax. Comience este paso mediante Ali Watting.

Cuatro veces 10 a la sexta de los TIMOCITOS reservados por muestra de citometría de flujo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. A continuación, agregue citoquinas en los pocillos de una placa de 96 pocillos para los controles de compensación. Luego bloquee los receptores FC en cada una de las muestras celulares mediante incubación con anti CD 1632 durante 10 minutos en hielo.

Ahora centrifugue la placa y luego elimine el líquido de los pocillos invirtiendo rápidamente la placa boca abajo en un fregadero. A continuación, resuspenda cada pocillo en 200 microlitros de tampón fax y repita el lavado. A continuación, incube las muestras experimentales con 200 microlitros de cóctel de anticuerpos o con anticuerpos individuales conjugados con fluorocromo para los controles de compensación. Todo en tampón fax, sobre hielo y en la oscuridad.

Después de 30 minutos, lave las células dos veces con tampón fax y, tras resuspender las células en tampón fax, transfiera las muestras a tubos fax en modelos transgénicos fisiológicos de TCR y ratones de tipo salvaje. La selección positiva comienza en la etapa doble positiva brillante antes de pasar a la etapa doble positiva opaca. Tras el encuentro con el antígeno, los timocitos doble positivo opacos ingresan luego en una etapa transitoria CD cuatro positivo CD ocho bajo antes de convertirse en CD cuatro.

Los timocitos maduros doblemente positivos o timocitos simples positivos para CD8 se caracterizan por su alta expresión de TCR y la pérdida de CD24. Aunque el perfil de CD8 frente a CD4 puede revelar defectos en la selección positiva, examinar TCR beta frente a CD69 o CD5 puede ofrecer mayor información sobre la localización del defecto. Tanto CD69 como CD5 se regulan al alza tras la estimulación del TCR, siendo interacciones más fuertes las que inducen una expresión más elevada de estos marcadores.

En este gráfico de TCR beta frente a CD69 en un ratón de tipo salvaje, la población TCR beta bajo y CD69 negativo representa una población de timocitos doble positivos previa a la selección. Por otro lado, la población TCR beta intermedio y CD69 positivo representa una población transicional inmediatamente posterior al reconocimiento del TCR y está compuesta por células doble positivo brillante, junto con algunas células doble positivo tenue y células CD4 positivo CD8 bajo. Aquí, la población TCR beta alto y CD69 positivo ilustra el grupo celular inmediatamente posterior a la selección positiva, que consiste en células doble positivo tenue CD4 positivo, CD8 bajo y células CD4 positivo único.

Finalmente, este perfil de células TCR beta alta CD69 negativo muestra una población más madura de células que consiste principalmente en células CD4 y CD8 de expresión única. La ausencia de las poblaciones TCR beta intermedia CD69 positivo y TCR beta alta CD69 positivo podría indicar alteraciones en la selección positiva. Los cambios en la proporción de células CD4 de expresión única frente a CD8 de expresión única dentro de la población TCR beta alta CD69 negativo pueden sugerir alteraciones en el compromiso de linaje.

La pérdida de las poblaciones TCR beta alta CD 69 positiva y TCR beta alta CD 69 negativa puede reflejar problemas de supervivencia tras la selección positiva. Examinar TCR beta mediante CD cinco es otra estrategia para identificar poblaciones antes y después de la selección positiva. Estas dos primeras poblaciones consisten principalmente en timocitos doble positivos brillantes.

La población con bajo contenido de TCR beta y bajo contenido de CD cinco representa timocitos doble positivos previos a la selección, y la población con nivel intermedio de TCR beta y nivel intermedio de CD cinco está compuesta por las células que inician la selección positiva. La generación deficiente de esta o la población anterior sugiere una selección positiva defectuosa. La población con nivel intermedio de TCR beta y alto contenido de CD cinco, sin embargo, representa timocitos en proceso de selección positiva y consiste principalmente en doble positivo tenue y positivos para CD cuatro.

Linfocitos T CD8 baja. La población TCR beta alta CD5 alta consiste principalmente en timocitos después de la selección positiva. Timocitos simples positivos cambios en la proporción de CD4, positivo simple a CD8.

Las células individualmente positivas dentro de esta población, a pesar de que las poblaciones anteriores sean normales, pueden sugerir alteraciones en el compromiso de linaje. Además, la ausencia de esta población puede indicar una supervivencia disminuida de timocitos tras la selección positiva, ya que la selección negativa implica la eliminación de pequeñas poblaciones específicas de antígeno. Los defectos en este proceso se observan mejor utilizando ratones transgénicos para el TCR; en timocitos de ratones CD cuatro HY, los timocitos que expresan el H-Y-T-C-R transgénico pueden detectarse con el anticuerpo monoclonal T 3.7.

El H-Y-T-C-R reconoce el antígeno específico masculino HY presentado dentro del MHC clase I db. Por lo tanto, los linfocitos T del timo positivos para el H-Y-T-C-R en ratones macho CD4 experimentan selección negativa, como se indica por una reducción en los números de timocitos doble positivos positivos para T3.70, y una disminución más marcada en los números de timocitos positivos para T3.7 y CD8 de simple positividad. En contraste, los ratones hembra CD4 HY experimentan selección positiva para generar linfocitos T positivos para T3.7 y de simple positividad para CD8.

Aunque una reducción en los números de timocitos doble positivos indica selección negativa, la ausencia de timocitos simples positivos específicos del antígeno es la medida más precisa. Un examen adicional de los pocos timocitos simples positivos para CD8 y T3.70 en ratones HY CD4 macho revela que la mayoría son células inmaduras con alta expresión de CD24. Mientras que la mayoría de los timocitos simples positivos para CD8 y T3.70 en ratones HY CD4 hembra han alcanzado la madurez y presentan baja expresión de CD24, lo que proporciona evidencia adicional de que ocurre selección negativa en los ratones HY CD4 macho.

Una limitación de los modelos transgénicos de TCR es que resulta difícil caracterizar adicionalmente la selección positiva mediante la identificación de poblaciones basadas en la expresión de TCR, CD69 o CD5 debido a la alta expresión de TCR durante todo el desarrollo de los timocitos. Los ratones HY CD4 hembras presentan una gran población de timocitos doble positivos positivos para T3.70 que experimentan selección positiva. Esto se indica mediante un aumento en la población positiva para CD69 en comparación con el tipo silvestre. La selección negativa implica un estímulo de TCR de mayor afinidad que la selección positiva. Esto se evidencia por una expresión más elevada de CD69 en los timocitos doble positivos positivos para T3.70 en los ratones HY CD4 machos, lo que provoca un desplazamiento del pico del histograma hacia la derecha.

Se observan tendencias similares con la expresión de CD cinco al analizar la selección tímica en ratones modificados genéticamente. Examinar la expresión de CD 69 o CD cinco puede determinar si el defecto se encuentra en la señalización del TCR o en un resultado posterior a la estimulación del TCR. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas y media para la preparación y tinción de células, más una hora adicional para la recopilación de datos en el citómetro de flujo.

Si se realiza correctamente, cada ratón adicional agregará aproximadamente 30 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular los timocitos con cuidado y asegurarse de haber planificado la estrategia de tinción previamente. Siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros ensayos, como ensayos de eliminación o ensayos de producción de citoquinas, para responder preguntas adicionales, como si los timocitos exportados funcionan adecuadamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar el desarrollo del sitio tímico utilizando citometría de flujo.