Una descripción visual de la disección de la vasculatura cerebral superficial y las meninges asociada y el plexo coroideo del cerebro de rata
14 de noviembre de 2012
Esta presentación en video muestra un método de recolección de las dos estructuras altamente vasculares más importantes que apoyan la función del cerebro anterior. Ellos son la superficie cerebral (superficial) vasculatura junto con meninges asociados (MAV) y el plexo coroideo que son necesarios para el flujo de sangre cerebral y líquido cefalorraquídeo (LCR) homeostasis.
El objetivo general de este procedimiento es diseccionar de manera eficiente y rápida la capa externa y las porciones aracnoideas de las meninges y la vasculatura arterial asociada, que recubren la superficie de la corteza del prosencéfalo y del mesencéfalo, el tálamo y los cuerpos callosos, así como obtener el plexo coroideo de los ventrículos laterales. Esto se logra primero eliminando la glándula pineal y separando las meninges y los árboles arteriales adyacentes al prosencéfalo. En segundo lugar, se retiran cuidadosamente las arterias y arteriolas de la superficie cortical, comenzando en el círculo ventral de Willis y luego avanzando hacia las superficies corticales dorsales, de modo que la capa externa y las membranas aracnoideas restantes permanezcan adheridas a la vasculatura, asegurándose de minimizar la recolección de tejidos adyacentes de la superficie cortical.
A continuación, se disecan la corteza y las fibras comisurales separándolas del septo y del hipocampo, exponiendo así los ventrículos laterales para permitir la extracción del plexo coroideo. Finalmente, se extrae el hipocampo, exponiendo el tálamo y los cuerpos del mesencéfalo. Luego se diseca la meninge y la vasculatura asociada que recubren esta región.
En última instancia, la integridad y especificidad de las meninges disecadas y la vasculatura arterial asociada, así como del plexo coroideo, pueden determinarse comparando los perfiles de expresión génica de cada una de estas regiones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en investigaciones relacionadas con la vascularización que sustenta la función cerebral. Incluye similitudes, comparaciones y diferencias en la función del plexo coroideo frente a las meninges y su vasculatura arterial asociada con respecto al flujo sanguíneo, la función del LCR, los daños neurotóxicos y el trauma cerebral.
Para comenzar este protocolo, coloque los cerebros recién extraídos de ratas inmediatamente después de que fueron sacrificadas en solución salina normal fría con hielo durante cinco minutos. Es importante permitir que el cerebro se enfríe durante este tiempo antes de la disección, para que las cuatro meninges cerebrales y la vasculatura arterial asociada o MAV puedan separarse de la superficie de la corteza. A continuación, coloque el cerebro en el fondo de una placa de Petri de vidrio sobre hielo con un centímetro de solución salina normal fría con hielo o solución tampón de fosfato sódico 0,1 molar a un pH de 7,4.
La disección debe realizarse con el cerebro, en su mayor parte, sumergido en solución salina. Para comenzar la disección, coloque el cerebro con la cara dorsal hacia arriba en la placa de Petri y localice la glándula pineal, que se encuentra en la región ventral más caudal entre los dos hemisferios. Justo por delante del cerebelo y justo debajo, o en la superficie de las meninges.
Sobre los colículos. Retire la glándula pineal utilizando dos pinzas pequeñas con punta curva. Tenga en cuenta que la glándula pineal es de color rosa, similar a la corteza, pero a menudo está rodeada por restos de sangre y vasos sanguíneos residuales provenientes de la extracción del cerebro.
A continuación, gire el cerebro boca abajo en la placa de Petri. Luego separe la arteria vertebral y las arterias más pequeñas y las meninges que cubren la protuberancia del resto de las meninges y la vasculatura del prosencéfalo. A continuación, comience la eliminación del MAV.
Es importante comenzar ventralmente en el proceso de disección con las arterias principales del círculo de Willis, las arterias cerebrales medias y las arterias anteriores. A continuación, comenzando por cualquiera de los hemisferios, utilice pinzas con punta curva pequeña para seccionar la arteria comunicante posterior justo posterior a la unión de la carótida interna, separando así los árboles arteriales más anteriores y posteriores del prosencéfalo. Luego repita el mismo procedimiento para el hemisferio contralateral.
Ahora, sujetando la AVM y la arteria anterior con la pinza, tire suavemente en dirección anterior dorsal para que la MAV que cubre la corteza anterior ventral se levante sobre y alrededor del tracto olfativo. Esto elimina gran parte de la MAV que cubre la corteza anterior. Gire el cerebro en un ángulo de 45 a 90 grados respecto a la placa de Petri, de modo que las regiones laterales más anteriores de la MAV que rodean las regiones corticales laterales puedan separarse de la corteza; sujete la AVM y las arterias asociadas y tire suavemente en dirección dorsal a lo largo de la corteza.
Si es necesario, se pueden usar los extremos de la pinza para levantar y liberar las arterias principales de la corteza durante la disección. Ahora, retire las regiones laterales más posteriores del MAV. Tenga en cuenta que es recomendable alternar de un hemisferio a otro durante este proceso de extracción para asegurar que el MAV permanezca frío e hidratado; también cambie de hemisferio si encuentra alguna resistencia al liberar el MAV de la corteza.
Finalmente, para eliminar las regiones más dorsales de la MAV que rodean la corteza somatosensorial primaria y la corteza motora, gire el cerebro con el lado dorsal hacia arriba para separar esta sección del cerebro, utilizando las puntas de la pinza a lo largo del seno sagital. Esta porción de la MAV obtenida puede mantenerse temporalmente en solución salina fría con hielo hasta que sea necesaria para pruebas y análisis, o puede congelarse para su posterior procesamiento. A menudo, la MAV que cubre las regiones corticales posteriores más caudales permanece adherida.
Su eliminación se muestra en una sección posterior de este video. Para retirar el plexo coroideo, coloque primero el cerebro con el lado dorsal hacia arriba y sostenlo en su lugar con la pinza grande. Luego, introduzca la pinza más pequeña hacia abajo a través de la línea media entre los hemisferios y utilice sus puntas para perforar la corteza y el cuerpo calloso hasta llegar a la parte superior de la línea media del hipocampo.
A continuación, utilice la pinza para separar la corteza con el cuerpo calloso del hipocampo dorsal y el septum, exponiendo así la mayor parte del ventrículo lateral. El plexo coroideo puede localizarse e identificarse mediante la línea roja ondulada que delimita la arteria principal que recorre su longitud. Utilice los dos extremos de la pinza para separar las paredes laterales del tercer ventrículo y ampliarlo en su extremo más inferior.
Luego, utilizando la pinza pequeña, tire de este extremo del plexo coroideo para liberarlo. A continuación, use la pinza para agrandar la región anterior situada entre el septum y la región del putamen caudado y libere también el plexo coroideo por este extremo. Realice asimismo el mismo procedimiento en el hemisferio contralateral para obtener el segundo plexo coroideo restante.
De nuevo, este tejido puede mantenerse temporalmente en hielo, solución salina fría, o congelarse para su procesamiento posterior. Para eliminar el MAV restante que cubre las regiones coddle más posteriores de la corteza, primero retire por completo el hipocampo de ambos hemisferios, exponiendo así el MAV sobre el tálamo y los colículos. Tenga en cuenta que la eliminación de esta porción del MAV será mucho menos difícil que su eliminación de la corteza para el MAV restante.
Al asir la vasculatura más grande que recubre la porción anterior del tálamo y tirar suavemente de la codilla, esta vasculatura se conecta con la red supraoculomotora y suministra sangre a la red del hipocampo dorsal y del tálamo dorsal. Tire suavemente hacia afuera y eventualmente se liberará la red supraoculomotora, permitiendo así alcanzar las últimas porciones del círculo arterial de la codilla. En este punto, se debe tener mayor cuidado para eliminar cualquier MAV restante en la superficie de las cortezas primarias granulares retros lineales, auditivas y visuales.
Cualquier MAV cortical ventral posterior restante cosechada con esta segunda sección de MAV tálamo y cuerpos callosos debe eliminarse y añadirse a la primera sección de MAV cortical diseccionada si se van a analizar por separado. A continuación, para comparar los perfiles de expresión génica entre el estriado, la corteza parietal y las regiones de MAV en condiciones control, se puede realizar un análisis de expresión génica utilizando matrices oligonucleotídicas Agilent 0 1 4 8 7 9 de genoma completo de rata, cuatro por 44.060 mer. Se pueden encontrar más detalles sobre el procesamiento, escaneo y almacenamiento inicial de datos en Thomas et al.
Cuando la disección se realiza correctamente, los tejidos de MAV resultantes deben consistir en dos entidades intactas que pesen aproximadamente entre 35 y 45 miligramos en total. El MAV inicialmente disecado que rodea la mayor parte de la corteza debe pesar aproximadamente 25 miligramos, y el que cubre el tálamo, los cuerpos callosos y la corteza occipital debe pesar alrededor de 15 miligramos.
El tejido debe tener un color ligeramente rosado debido a la sangre residual en la vasculatura. El plexo coroideo bilateral cosechado debe estar en dos muestras de tejido intactas, cada una pesando de uno a dos miligramos, como se observa aquí. Aquí vemos una comparación de los perfiles de expresión génica en el estriado, la corteza parietal y el MAV bajo condiciones control.
El gráfico superior muestra la expresión en el estriado en comparación con la corteza parietal. Mientras que el gráfico inferior muestra la expresión en el MAV en comparación con la corteza parietal, puede observarse que el estriado y la corteza parietal están mucho más estrechamente relacionados entre sí que el MAV. Aquí se muestra la expresión diferencial de genes en el MAV en respuesta a la hipertermia en comparación con el control, en respuesta a la anfetamina en comparación con el control, y en hipertermia versus anfetamina.
Por último, aquí observamos genes con una expresión mayor a 15 veces en el MAV en comparación con la corteza parietal y el estriado, caracterizados por su función. Muchos de estos genes están relacionados con el sistema vascular y/o el sistema inmunitario. Otros genes con cambios de expresión muy elevados son proteínas de la matriz extracelular, transportadores de saute, y genes implicados en el metabolismo de lípidos y del ácido retinoico.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar ser paciente durante la disección de la VMA. También es fundamental mantener el cerebro sumergido en solución salina isotónica o en solución salina tamponada con fosfatos durante toda la disección. Asimismo, se recomienda practicar la sección de la VMA en cuatro o cinco ratas antes de obtener tejidos para generar datos experimentales.
Resumen
Esta presentación en video demuestra un método para extraer la vasculatura de la superficie cerebral y el plexo coroideo, esenciales para mantener el flujo sanguíneo cerebral y la homeostasis del líquido cefalorraquídeo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología vascular
- Neuroanatomía
Antecedentes
- La vasculatura de la superficie cerebral y el plexo coroideo son vitales para la función cerebral.
- Comprender sus funciones puede orientar la investigación sobre la dinámica del líquido cefalorraquídeo.
- Las técnicas de disección son esenciales para estudiar estas estructuras.
- Los perfiles de expresión génica pueden revelar diferencias funcionales entre estos componentes vasculares.
Objetivo del estudio
- Para diseccionar y extraer eficientemente las meninges y la vasculatura asociada.
- Para explorar la relación entre el plexo coroideo y la función del líquido cefalorraquídeo.
- Para proporcionar información sobre los daños neurotóxicos y el trauma cerebral.
Métodos Utilizados
- Diseción de las meninges y la vasculatura arterial de cerebros de rata.
- Eliminación cuidadosa del plexo coroideo de los ventrículos laterales.
- Uso de pinzas para una recolección precisa mientras se minimiza el daño a los tejidos adyacentes.
- Comparación de los perfiles de expresión génica para evaluar la integridad de los tejidos recolectados.
Resultados principales
- La disección exitosa de las meninges y la vasculatura asociada.
- La recolección del plexo coroideo se logró con daño tisular mínimo.
- El análisis de la expresión génica indicó perfiles distintos para cada región recolectada.
- Conocimientos obtenidos sobre los roles funcionales del plexo coroideo y las meninges.
Conclusiones
- Este método proporciona un enfoque confiable para estudiar las estructuras vasculares cerebrales.
- Comprender estos componentes puede mejorar el conocimiento sobre la dinámica del líquido cefalorraquídeo.
- La investigación futura puede basarse en estos hallazgos para abordar la función cerebral y la patología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite a los investigadores de biofármacos aislar y analizar dos estructuras neurovasculares críticas: la vasculatura asociada a las meninges (MAV) y el plexo coroideo, lo que apoya la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos para el sistema nervioso central (SNC). Al proporcionar tejido bioquímicamente viable para el perfilado de expresión génica, facilita la reducción mecanicista de riesgos en las vías de homeostasis vascular y de líquidos implicadas en trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos. El enfoque mejora la confianza predictiva en las primeras etapas del descubrimiento al vincular la función vascular con agresiones neurotóxicas, como la exposición a anfetaminas o la hipertemia.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de la expresión génica relacionada con el sistema vascular y el sistema inmunitario en el MAV para validar dianas implicadas en el acoplamiento neurovascular y en la función de la barrera hematoencefálica.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo estandarizado de disección que produce tejidos intactos de MAV y plexo coroideo adecuados para análisis ómicos posteriores.
- Valor predictivo: Facilita el descubrimiento de biomarcadores al revelar diferencias en la expresión génica en respuesta a desafíos neurotóxicos, lo que ayuda en la priorización de dianas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera preparaciones de tejido con integridad vascular preservada, lo que permite el desarrollo confiable de ensayos para dianas cerebrovasculares y reguladoras del LCR.
- Valor operativo: La disección toma de 5 a 10 minutos, lo que posibilita la preparación de tejido de alto rendimiento para campañas de cribado.
- Valor de reproducibilidad: La recolección consistente de MAV (~25–35 mg asociada a la corteza, ~15 mg tálamica) y del plexo coroideo (1–2 mg por lado) permite una entrada estandarizada para análisis comparativos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor traslacional: Los tejidos obtenidos son modelos relevantes para la enfermedad que permiten estudiar las respuestas vasculares a agresiones que imitan condiciones clínicas como la lesión cerebral traumática y la neurotoxicidad.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Las comparaciones de expresión génica entre el MAV, el plexo coroideo y las regiones corticales ayudan a reducir riesgos en los blancos al aclarar la señalización específica del compartimento vascular frente a la del parénquima del sistema nervioso central.
- Continuidad preclínica: Permite la evaluación longitudinal del compromiso de blancos vasculares desde la fase de descubrimiento hasta las etapas preclínicas mediante el aislamiento consistente de tejidos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se enmarca en la fase temprana del descubrimiento, apoyando la validación de objetivos guiada por hipótesis y contribuyendo a la identificación de compuestos activos mediante la elucidación de vías vasculares.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías al aislar la vasculatura meníngea y el plexo coroideo para estudiar sus funciones distintas en el flujo sanguíneo cerebral y la homeostasis del LCR.
- Selección: Produce insumos tisulares estandarizados que permiten pruebas reproducibles de compuestos en ensayos vasculares e inmuno-neurales.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos de expresión génica (por ejemplo, mediante matrices Agilent de genoma completo de rata) que permiten comparar las respuestas vasculares en diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Apoya la alineación de biomarcadores mediante la vinculación de los perfiles moleculares del MAV y del plexo coroideo con estados fisiopatológicos como la neurotoxicidad inducida por hipertermia.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de aislamiento tisular aplicable en múltiples proyectos del SNC que estudian objetivos vasculares, meníngeos o del plexo coroideo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías neurovasculares y relacionadas con el LCR.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante una técnica estandarizada de disección y manejo del tejido en solución salina isotónica.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos tempranos sobre la respuesta vascular, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas de los programas del SNC.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en la interacción vascular con el blanco y su relevancia funcional en la homeostasis cerebral.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neuroanatomía y técnicas de disección microquirúrgica para aislar tejidos meníngeos y vasculares delicados.
- Depende de instrumentos de disección, como pinzas finas, y de un ambiente controlado (solución salina fría en hielo) para mantener la viabilidad del tejido.
- Exige una estandarización entre equipos de histología, biología molecular y farmacología para lograr una preparación y análisis de tejidos consistentes.
- Las consideraciones de adaptación incluyen ajustar la profundidad de la disección según la cepa o la edad de las ratas para evitar contaminación cortical.
- Limitación práctica: riesgo de desgarro meníngeo o daño vascular si la disección se realiza demasiado rápido o sin una hidratación adecuada del tejido.
