Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

El objetivo general de este procedimiento es medir el sueño definido por EEG y la concentración de lactato durante la estimulación optogenética en coordenadas estereotáxicas precisas. Implante quirúrgicamente los electrodos electroencefalográficos necesarios y las cánulas para un sensor de lactato y un cable de fibra óptica. Luego, inserte el cable de fibra óptica y el sensor de lactato previamente calibrado en sus cánulas guía en el cráneo del animal.

A continuación, ajuste la intensidad del estímulo de luz azul para lograr la respuesta electrofisiológica deseada. Luego, proceda a recopilar los datos de electroencefalografía, electromiografía y concentración de lactato mientras se permite que el animal presente un comportamiento espontáneo o duerma. En comparación con otros métodos como los estudios farmacológicos del EEG, este enfoque experimental tiene la ventaja de monitorear la bioquímica y la electrofisiología cerebrales mientras la actividad de las neuronas se manipula en tiempo real a una escala de tiempo subsegundo.

Por lo tanto, el potencial para obtener nuevos conocimientos en el campo de la investigación del sueño es alto. Por ejemplo, se pueden identificar los correlatos metabólicos y electrofisiológicos del sueño de onda lenta. Este tipo de experimento también puede aplicarse en otras áreas de la neurociencia, como el aprendizaje y la memoria, la plasticidad sináptica o los trastornos convulsivos.

La técnica quirúrgica es técnicamente desafiante. Requiere una buena dosis de destreza, pero esto puede lograrse mediante la práctica. En esta demostración visual, repetiré los pasos críticos de algunos procedimientos quirúrgicos complicados que complementarán la descripción escrita.

Una vez que un animal se ha recuperado de la cirugía, el desafío consiste en insertar adecuadamente el sensor de lactato y el cable de fibra óptica. Jonathan y yo demostraremos cómo utilizar una mano firme al inmovilizar al animal para insertar estos dos dispositivos delicados. Por último, mostraremos cómo optimizar la respuesta del EEG ajustando en tiempo real la intensidad del estímulo.

Para este experimento, utilice ratones transgénicos que expresen el canal catiónico sensible a la luz azul. El canal se expresa en dos neuronas corticales cerebrales. Primero, anestesie al ratón usando 5% de isoflurano, 95% de oxígeno para la inducción, mientras mantiene la anestesia con 3% de isoflurano, 97% de oxígeno.

Realice una incisión medial en la parte superior del cráneo desde entre los ojos hasta la parte posterior del cráneo. Limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno y solución salina estéril. Localice y marque B y Lambda para determinar las coordenadas estereotáxicas para las configuraciones de estímulo optogenético con electrodos; marque previamente los orificios para los tornillos con un taladro dental de alta velocidad equipado con una fresa esférica de 0,5 milímetros, seguida de una fresa esférica de 0,7 milímetros.

Inserte los tornillos de electrodo de un gramo en los orificios con un destornillador manual ranurado. Enrósquelos aproximadamente cuatro a cinco vueltas para alcanzar la profundidad deseada. Sostenga las cánulas guía en su lugar con una cánula estereotáxica y luego fíjelas al cráneo y a los anclajes con cemento acrílico. Para mantener la permeabilidad, cada cánula guía debe contener una cánula ficticia o un estilete desde el momento de la cirugía hasta el momento del experimento.

Una vez que los EEG y las cánulas guía estén colocados en el cráneo, únalos con una capa fina de cemento acrílico dental. Después de que el cemento se endurezca, coloque el conector plástico sobre el montículo de cemento seco, conectando los extremos de los cables que salen de las derivaciones EEG a los contactos del conector plástico, en caso de que los cables queden atrapados en el cemento. Luego, pase los cables del electromiograma a través de los músculos nucleares deslizándolos dentro del cilindro de una aguja de calibre 21.

Atraviese el músculo y ate un nudo quirúrgico doble con sutura de nylon cinco cero alrededor de estos cables, justo distal al punto donde salen del músculo. Vuelva a suturar el tejido cutáneo que fue retraído para acceder al tejido muscular mediante nudos quirúrgicos simples interrumpidos, utilizando una aguja P tres con filo invertido y sutura de nylon cinco cero. Una vez programada la unidad estimuladora mc, utilícela como generador de señales independiente con una señal binaria de encendido-apagado de cinco voltios. Conecte la unidad estimuladora mc a la unidad de potencia habilitada para TTL del láser mediante conectores BNC.

Conecte la unidad de alimentación láser al láser mediante un cable plano. También conecte el láser al conector FC macho del cable de conexión de fibra óptica origen. Conecte el cable de fibra óptica origen al acoplamiento rotatorio.

La junta rotativa de fibra óptica sirve como conmutador. A medida que el animal se mueve por su jaula, la junta rotativa gira para evitar la rotura de los cables de fibra óptica debido al par de torsión. Fije el conmutador a un soporte metálico colocado encima de la jaula cilíndrica en la que se encuentra el animal utilizando bridas de plástico.

Restrinja al ratón utilizando una mano para sujetarlo bajo una palma en forma de copa. Oriente la cabeza entre el dedo medio y el índice del experimentador. Ahora limpie la cánula guía de residuos, utilizando una aguja estéril de calibre 25.

Luego inserte el cable de fibra óptica manualmente y sujételo a la cánula guía de fibra óptica mediante una tapa roscada. Controle la profundidad de inserción del cable de fibra óptica en el cerebro mediante un nudo de sutura atado al cable de fibra óptica a una distancia fija desde el extremo plano y cortado. El sensor se equilibra en solución salina tamponada con fosfato y se expone a tres concentraciones de L-lactato de forma escalonada.

Según los protocolos del fabricante, inserte el sensor previamente calibrado en la cánula guía para lactato montada en el cráneo, de manera idéntica al procedimiento de inserción del cable de fibra óptica. Conecte el sensor de lactato al preamplificador del biosensor Pinnacle 8,400 mediante conectores de clavija bipolar. A continuación, conecte este preamplificador al conector de ocho pines en el montaje craneal implantado quirúrgicamente.

Antes de recopilar datos, use el botón de control de intensidad del láser para ajustar la intensidad del estímulo optogenético. La amplitud de la respuesta EEG variará entre animales debido a factores que no han sido estudiados de forma sistemática. Por lo tanto, es necesario ajustar la intensidad del estímulo optogenético y verificar que la respuesta EEG sea adecuada cuando se logre la respuesta deseada.

Recopile datos utilizando el sistema Pinnacle 8, 400 con el neuro score. Una interfaz SEIA clasifica los estados de sueño mediante inspección visual de los datos de EEG y EMG procesados. Los datos se registran en épocas de diez segundos como vigilia, sueño no REM (movimiento ocular rápido) o sueño REM según el EEG y el EMG.

Esta configuración de estímulo optogenético del biosensor muestra los electrodos de EEG implantados quirúrgicamente, el sensor de lactato y la cánula para la estimulación optogenética. En ausencia de estimulación optogenética, este ratón experimentó sueño espontáneo. Se monitorearon continuamente las transiciones entre estados de vigilia y los dos subtipos de sueño, junto con el EEG-EMG y la concentración cerebral de lactato.

El movimiento ocular rápido y el movimiento ocular no rápido se definen en función del EEG y del EMG. Curiosamente, la corriente del biosensor de lactato aumenta en función de un EEG de baja amplitud y disminuye en función de un EEG de alta amplitud. Ambos canales del EEG responden a estímulos optogenéticos aplicados en la corteza frontal.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implantar quirúrgicamente un ratón para realizar simultáneamente manipulación optogenética y medición del electroencefalograma, electromiograma y concentración de lactato en el cerebro. Una vez dominada, esta técnica quirúrgica puede realizarse adecuadamente en 90 a 120 minutos. Recuerde monitorear constantemente la respiración del animal como indicador de la profundidad de la anestesia.

Si el animal respira con menos frecuencia que una vez cada cuatro o cinco segundos, la anestesia podría ser demasiado profunda. Si el animal respira con más frecuencia que una vez cada dos segundos, la anestesia podría ser demasiado ligera. Recuerde tomar las precauciones de seguridad adecuadas al usar el agente anestésico gaseoso isoflurano.

Asegúrese de contar con una ventilación adecuada en el quirófano para proteger su retina del láser utilizado para la estimulación optogenética. Use gafas de protección o coloque al animal dentro de un gabinete opaco a la luz. Deberá practicar la implantación del biosensor de lactato y del cable de fibra óptica en un ratón completamente despierto.

Los ratones no cumplen con estos procedimientos y deben inmovilizarse. Sin embargo, la restricción no debe ser tan fuerte como para lesionar al animal o impedir la respiración.