Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

El objetivo general de este procedimiento es aislar, caracterizar y diferenciar células madre del pulpo dental humano de dientes permanentes mediante dos métodos. Esto se logra recolectando muelas del juicio incluidas sanas, cortándolas alrededor de la unión cemento-esmalte al inicio. Las células madre del pulpo dental (D PSCs) se aíslan mediante dos métodos diferentes.

En el primer método, los tejidos de pólipo se digieren enzimáticamente mediante incubación en colagenasa tipo uno más solución de espacio discal. Aquí los denominamos ed. Considerando el método de aislamiento en el segundo método, los tejidos palp se colocan únicamente en el frasco sin ninguna digestión.

De esta manera, las dpss comienzan a migrar desde el tejido hacia el matraz. Estas células denominadas OG hacen referencia al método de aislamiento por crecimiento periférico. El segundo paso del procedimiento es la identificación de células madre mediante citometría de flujo.

El tercer paso del procedimiento es la inducción de la diferenciación de odontoblastos, y el paso final es la evaluación comparativa de la diferenciación de odontoblastos entre dos grupos mediante tinción en rojo y QBCR. Soy RA Kde del Departamento de Células Madre y Biología del Desarrollo del Instituto Rian. Hoy les mostraré el aislamiento, caracterización y diferenciación comparativa de células madre mesenquimales humanas utilizando dos métodos.

Hola, soy el Dr. Rezaian del Instituto Rio. Estamos trabajando en un proyecto relacionado con células madre del pulpo dental humano. Estas células son un tipo de células madre mesenquimatosas, que son fáciles de obtener con mínima molestia y morbilidad.

Las células madre mesenquimales se caracterizan por su capacidad plástica de formar colonias y su potencial de diferenciación múltiple. Hola, soy la Dra. Ami del Departamento de Células Madre. En el instituto, utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para aislar células madre con fines de estudios de investigación y aplicaciones futuras.

En medicina regenerativa, el primer paso para utilizar esta fuente de células madre en futuras terapias basadas en células madre consiste en elegir el mejor protocolo para aislar células madre a partir de tejido pulpar humano. Para alcanzar este objetivo, es fundamental investigar ciertos aspectos del comportamiento celular bajo distintas condiciones de aislamiento de células madre. Primero, voy a aislar células madre de la pulpa dental humana mediante la disociación enzimática de la pulpa o mediante la migración de células madre a partir de implantes de tejido.

Luego, caraterícelos y diferéncielos en blastocito. Así que comencemos. En primer lugar, disuelva la enzima y la colagenasa tipo I en PBS.

Luego, filtrelos utilizando un filtro de jeringa de 0,2 micrones. Transfiera ambos al tubo cónico. A continuación, agregue pener y PBS para obtener una concentración final.

Transfiera dientes del juicio sanos al laboratorio en medio básico frío y bajo condiciones estériles. Limpie la superficie del diente con etanol al 70 % antes de estudiarlo. Asegúrese de eliminar cualquier partícula de la superficie del diente.

Corte el diente alrededor de la unión cemento-esmalte utilizando un disco dental esterilizado para exponer la cámara pulpar. Debe tenerse en cuenta que el proceso de corte debe realizarse lentamente para reducir el sobrecalentamiento del tejido dental. Luego, separe suavemente el tejido pulpar de la corona, es decir, corte el tejido pulpar en fragmentos de uno a dos milímetros con la hoja de Scarpa.

Transfiera pequeñas porciones de tejido pulpar a una mililitro de solución enzimática durante una hora a 37 grados Celsius, agitando en vórtex cada 30 minutos para ayudar a desagregar los tejidos pulpares. Posteriormente, elimine los agregados grandes pasándolos a través de un filtro celular de 70 micrones. Luego, agregue PBS que contenga PENER y centrifugue a 1.200 RPM durante cinco minutos.

Retire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, suspendemos la placa en el medio de proliferación pm, la transferimos al frasco de cultivo y agregamos medio. Luego, incubamos.

Cambie el medio cada tres días hasta alcanzar la confluencia celular para el método de trabajo externo. Repita el proceso de corte. Después de cortar, coloque los tejidos dentales en fragmentos de uno a dos milímetros.

Luego colóquelos en el cultivo. Incube con el medio de proliferación. Debe tenerse en cuenta que el volumen total del medio de proliferación debe favorecer la adhesión de todos los fragmentos para el posterior crecimiento celular.

Cambie el medio después de observar el crecimiento y luego cada tres días hasta alcanzar la confluencia celular. Para la inmunofenotipificación, incube ambos tipos de D PSC con anticuerpos conjugados con PE o FITC durante 30 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Luego agregue PBS y centrifugue a 1.200 RPM durante cinco minutos.

Elimine el sobrenadante, resuspenda la placa en PBS y finalmente evalúe los marcadores de superficie mediante citometría de flujo. Subcultive ambos tipos de DPC durante tres pasajes. Luego, retire con tripsina en hielo y transfiera las células a seis placas de cultivo rojas con una confluencia del 60 %, reemplazando el medio de mantenimiento (PM) por medio odontogénico. Deje tres pocillos como control negativo añadiendo PM.

Cambie el medio cada tres días; en el día 21, lave las células con PBS. Luego, fíjelas con un mililitro por pocillo de gel de formal al 10 % durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de 15 minutos, retire cuidadosamente el fijador y enjuague las células tres veces con agua destilada. Luego, sustituya el agua por un mililitro por alza roja en solución de tinción roja. Después de 20 minutos, eliminamos el exceso de colorante y lavamos las células cuatro veces con agua desionizada.

Luego, agregue un milímetro por pozo de agua para evitar que las células se sequen. Después de la tinción, puede observar tres rieles superiores que se vuelven rojos en comparación con los controles bajo el microscopio; puede ver la absorción del colorante alrededor de la célula mediante un aumento elevado para la cuantificación de la tinción roja. Después de eliminar el agua, agregue un mililitro por pozo de ácido acético al 10 % y luego incube durante 30 minutos con agitación.

Luego, retire suavemente las células de la placa utilizando un raspador celular. A continuación, transfiéralas a tubos separados. Agite vigorosamente durante 30 segundos.

Luego, caliente a 85 grados Celsius durante 10 minutos. Para evitar la evaporación, selle los tubos con ParaView y transfiera los tubos a hielo durante cinco minutos; luego centrifúgelos a 20.000 G durante 15 minutos. Mientras tanto, prepare una dilución seriada estándar de rojo de aluminio según el protocolo de la región.

Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y transfiera los tubos a nuevos tubos. Neutralice el pH con hidróxido de amonio al 10 %. Luego agregue los patrones y también las muestras en 96.

Coloque en placas de cultivo y luego mida la absorbancia a 405 nanómetros y analice los datos según la dilución seriada estándar. Aquí puede observar DPCs, que se aíslan mediante disociación enzimática en los días 10, 15 y 18, así como DPCs expandidos en los días 5, 10, 13 y 18. Ambos tipos de dpss en el caso tres tienen casi el mismo tamaño y morfología. Los resultados de inmunofenotipado muestran la presencia de marcadores de células madre mesenquimales como CD 44, CD 73 y CD 19, y la ausencia de marcadores hematopoyéticos y endoteliales como CD 34, CD 45 y CD 11 B. Curiosamente, las expresiones de CD 1 0 5 y CD 146 son mayores en las dPSCs expandidas en comparación con las D-P-S-C-E-D. La cuantificación de la tinción roja de enzima en el día 21 de diferenciación en odontoblastos muestra una mayor deposición de calcio en las D-P-S-C-E-D en comparación con las células madre dentales sin inducir.

Los resultados de qPCR también indican expresiones significativamente más altas de MEP y A LP como marcadores de mineralización en D-P-S-C-D en comparación con las células madre dentales salientes. Mientras tanto, ambos genes se regulan durante la diferenciación y además la expresión de DSPP como marcador odontogénico aumenta durante la diferenciación. Sin embargo, no hay variación significativa en la expresión de DSVP en células diferenciadas entre los grupos ED y OG.

Acabamos de mostrarle cómo aislar células madre de partes dentales humanas utilizando ya sea la disociación enzimática de la pulpa o el crecimiento de células madre a partir de explantes de tejido. Eso es todo. Le deseamos mucha suerte al intentar utilizar este procedimiento en su experimento.

Gracias.