Análisis de la fusión de la membrana SNARE mediada usando un ensayo de fusión celular enzimática

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los eventos de fusión celular mediados por snare mediante la expresión activada de beta galacto. Esto se logra primero expresando ectópicamente las proteínas v y t snare en la superficie de células cost siete. El siguiente paso del procedimiento consiste en combinar las células que expresan proteínas snare V con aquellas que expresan proteínas snare T.

Esto da como resultado la fusión celular mediada por snare y la expresión activada de beta galacto. En última instancia, la actividad de beta galacto inducida por la fusión celular se mide utilizando un espectrofotómetro. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos existentes, como el ensayo de la región SAL microscópica, es que puede analizar múltiples combinaciones de snare.

Cuantitativamente, aunque este método puede aplicarse para comprender el mecanismo y la regulación de la fusión de membranas mediada por snare, también puede utilizarse para realizar estudios de alto rendimiento. El procedimiento será demostrado por Doc Na Hassan, un posdoctorado, y David Humphrey, un técnico de mi laboratorio, el día anterior a la carga de la transfección.

Prepare placas de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 12 milímetros, utilizando dos pocillos para cada combinación de células que expresan plásmidos únicos en el experimento sobre dichos cubreobjetos. Siembre 30 000 células COS-7 cultivadas en DMEM suplementado con 4,5 gramos por litro de glucosa y 10% de suero bovino fetal para transfectar. A cada pocillo, añada un cuarto de microgramo del plásmido TTA y un conjunto de plásmidos de expresión.

Proteínas invertidas de interés en este caso, vampiros invertidos para transfectar los linfocitos T, agregue un cuarto de microgramo del plásmido que codifica TRE falta Z y el conjunto complementario de plásmidos que codifican las proteínas invertidas de interés. En este caso, snap 25 syntaxina uno y syntaxina cuatro. Ahora transfecte el coste siete con lipectomía según las instrucciones del fabricante y cultive las células durante 24 horas. Veinticuatro horas después de la transfección, fije las células en paraformaldehído suplementado durante 10 minutos. Tras la fijación, enjuague las células tres veces con PBS más más, luego bloquee las células con FBS suplementado durante 30 minutos.

Después del bloqueo, incubar las células con el anticuerpo monoclonal anti mic durante 30 minutos. Tras cuatro lavados con PBS más más, incubar las células durante una hora con anticuerpos secundarios conjugados con fitina en una dilución de uno a 500. Después de cuatro lavados adicionales con PBS más más, montar las células marcadas en un reactivo comercial antidesvanecimiento.

Las células ya están listas para la microscopía confocal. El día anterior a la transfección, siembre 1,2 millones de células Coss-7 en cada placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros y 200 000 células Coss-7 en cada pocillo de placas de seis pocillos, para cada combinación de plásmidos que se analizará. Prepare un pocillo por cada cultivo y cultive las células durante 24 horas. Al día siguiente, agregue los plásmidos para la transfección. Para las células V, transfecte un plásmido que exprese la proteína de interés invertida y cinco microgramos de pTet-Off a las células en cada placa de cultivo de 100 milímetros.

Transfecte células de control en una placa de cultivo de 100 milímetros con un vector vacío y P te apagado a las mismas concentraciones relativas que las células V. Después de que todos los plásmidos se hayan añadido a las células V y a las células de control, agregue tcom micina a esos pocillos para prevenir la N-glicosilación de las vamps. En cada pocillo de las placas de seis pocillos, realice una transfección conjunta de las células T con un microgramo de PBIG junto con los plásmidos complementarios que expresan las proteínas de interés.

Ahora, transfecte las células cost siete con lip según las instrucciones del fabricante. Luego, cultive las células durante 24 horas; 24 horas después de la transfección, desprenda las células V de sus placas de cultivo con tampón de disociación celular libre de enzimas. Comience lavando las células una vez con 20 mililitros de PBS.

Luego, agregue cinco mililitros de tampón de disociación libre de enzimas. Después de un periodo de incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, las células se desprenderán al golpear bruscamente la placa; verifique bajo el microscopio que se hayan desprendido. Si menos de la mitad de las células se han desprendido, espere otros cinco minutos y golpee la placa nuevamente.

Continúe la incubación en tampón de desprendimiento hasta que más de la mitad de las células se hayan desprendido. Luego, cuente las células V con un citómetro de hemocitómetro. A continuación, resuspenda las células V a una concentración de aproximadamente 480.000 células por mililitro en tampón DMEM Heis suplementado.

Ahora agregue un mililitro de células V resuspendidas a cada pocillo que contiene las células T y devuelva las placas al incubador. Después de seis, 12 o 24 horas de cultivo conjunto de las células, lávelas con PBS y agregue tampón de lisis. A continuación, raspe las células de los pocillos y transfiéralas a tubos para centrifugar.

Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y mida la expresión de beta galacto utilizando un ensayo disponible comercialmente según las instrucciones del fabricante. Durante ese protocolo, asegúrese de detener la reacción colimétrica después de 90 minutos mediante la adición de carbonato de sodio uno molar para cuantificar los resultados. Mida la absorbancia a 420 nanómetros en un espectrofotómetro. Cuando las células CO7 fueron transfectadas con plásmidos snare invertidos, las proteínas snare invertidas se expresaron en la superficie celular.

Se utilizó citometría de flujo para medir los niveles de expresión de las proteínas snare en la superficie celular. Con el fin de comparar sus capacidades de fusión de membrana, fue necesario expresar las vampas al mismo nivel. Por lo tanto, se tituló y optimizó la concentración de cada plásmido snare invertido utilizado en la transfección.

Bajo tales condiciones, las vampirinas 1, 3, 4, 5, 7 y ocho y la sintaxina uno y cuatro se expresaron al mismo nivel en la superficie celular, respectivamente; los complejos SNARE neuronales que median la exocitosis sináptica se utilizaron para probar la factibilidad del ensayo. De hecho, cuando se combinaron células V que expresaban vampirina dos y células T que expresaban SINTAXINA uno y SNAP 25, se detectó una expresión robusta de beta-galactosidasa. Sin embargo, cuando no se expresaba bien fuera vampirina dos o SNAP 25, solo se detectó una actividad basal de beta-galactosidasa, lo que indica que la fusión celular y la expresión de beta-galactosidasa dependen en general de las interacciones entre los SNARE v y t. En conjunto, SINTAXINA uno, SNAP 25, vampirina uno, vampirina tres y vampirina ocho presentaron actividades de fusión comparables y las más altas.

En contraste, la actividad basal de beta GAL sugiere que la combinación de proteínas no induce la fusión de membranas, como ocurre en el caso entre vamp cinco y SYNTAXIN uno. Snap 25. Durante la realización del ensayo enzimático de fusión, es importante recordar añadir la unicitamicina para prevenir la an-glicosilación de las proteínas esna y añadir DTT para evitar la formación de enlaces disulfuro entre las proteínas esna.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el ensayo de fusión celular.