Citometría de masas: Protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas CyTOF

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el ajuste diario adecuado y el análisis de muestras en un instrumento CyTOF. Primero, se ensambla la máquina y se enciende. A continuación, se optimizan los parámetros del instrumento para el ajuste, a fin de obtener la señal máxima.

Entonces, la máquina está lista para ejecutar las muestras. En el último paso, se limpia y apaga la máquina. En última instancia, se pueden obtener datos óptimos de las células según los requisitos de tiempo específicos.

La demostración visual de esta técnica es fundamental. Los procedimientos diarios de configuración, calibración y limpieza son difíciles de aprender a partir del manual, ya que implican múltiples pasos de software simultáneos.

Es necesario adquirir experiencia para desarrollar una sensación sobre los niveles de fondo adecuados y las intensidades de señal. Al menos 15 minutos antes de comenzar un experimento, abra el programa de software CyTOF y seleccione la configuración del instrumento. Luego, en la pestaña del bastidor, haga clic en el botón de encendido del calentador para permitir que la camisa de la cámara de pulverización alcance los 200 grados Celsius.

Sustituya la jeringa en la bomba de jeringas por una jeringa nueva llena con agua milli cube. Luego, limpie el nebulizador realizando una retrofusión con Citron al 5 % dos veces a través de cada puerto. Para eliminar cualquier residuo de Citron, repita la retrofusión con agua Milli Q.

A continuación, abra la válvula del tanque de gas argón, lo que hará que se encienda la luz de Argonne en la parte frontal de la máquina. Luego, conecte el nebulizador a la entrada del gas de compensación y conecte el nebulizador al tubo de introducción de líquido. Introduzca el extremo del nebulizador en la abertura blanca del manto calefactor en la pestaña del controlador RFG de la ventana de configuración del instrumento.

Haga clic en iniciar plasma, luego haga clic en aceptar. Después de que haya finalizado el arranque, haga clic en aceptar nuevamente en la ventana emergente. Ahora encienda la bomba de jeringa.

Al rellenar la jeringa, presione el botón de detención en lugar del botón de pausa para restablecer el contador de volumen. Antes de calibrar el citómetro de masas, asegúrese de que haya calentado durante 20 minutos. Una vez que la máquina se haya estabilizado, haga clic en el botón de configuración de adquisición para abrir la ventana de configuración de adquisición de datos. En la pestaña de analitos.

Haga clic en la tabla periódica para abrir el panel de selección de isótopos. Luego seleccione los isótopos en la solución de ajuste de DVS Sciences que se enumeran en el manual y haga clic en guardar. A continuación, haga clic en el botón isótopos por lectura para abrir la ventana de masas por lectura.

Seleccione el número de pulsos y reescala el eje y ingresando un nuevo número y luego presionando enter. Ahora llene una jeringa verde de un mililitro norm inject con la solución de ajuste. Gire el selector de puerto de muestra a cargar.

Inyecte 450 microlitros de solución de calibración y luego gire el selector a la posición de inyección. Espere hasta que los isótopos de la solución de calibración comiencen a aparecer como trazas en esta pantalla. Las señales en el tiempo de vuelo, en la región de 9 400 a 9 800, se deben a isótopos de xenón en el gas argón.

Ahora regrese a las masas por ventana de lectura y haga clic en el botón verde de reproducción. Cada línea de color representa isótopos seleccionados de la pestaña de analitos. Cuando los niveles de isótopos sean estables, ajuste la corriente seleccionando la corriente actual desde el menú desplegable en la pestaña de parámetros de la ventana de configuración de adquisición de datos.

En la ventana de inicio, ingrese cero para finalizar, ingrese 10. Para el valor de paso, ingrese 0,5 y para el tiempo de estabilización, ingrese 200. Luego, haga clic en guardar.

Luego, haga clic nuevamente en la ventana de masas por lectura y haga clic en reproducir. Después de anotar dónde alcanzan su máximo las señales de los isótopos, vaya a la pestaña de configuración del canal DAC en la ventana de configuración del instrumento. Desplácese hacia abajo hasta la corriente e ingrese el valor del pico del isótopo.

Haga clic para establecer el valor de corriente actual y luego guarde. A continuación, cambie el menú desplegable para seleccionar el gas de relleno. Introduzca 0,55 en la ventana de inicio, 0,95 en la ventana final, 0,05 en la ventana de valor de paso y 200 en la ventana de tiempo de estabilización.

Haga clic en guardar. Después de regresar a la ventana de masas por lectura y hacer clic en reproducir nuevamente, el eje x mostrará ahora el caudal del gas de arrastre. Tome nota de los valores en los que las señales de los isótopos alcanzan su pico y observe el aumento rápido de la señal GD 1 55 cerca del final.

Luego regrese a la pestaña de configuración del canal DAC. Desplácese hacia abajo hasta el apartado de compensación de gas e ingrese el nuevo valor del pico del isótopo. Haga clic en establecer el valor de corriente actual.

Luego, haga clic en guardar nuevamente para registrar la relación del isótopo deseado frente al óxido. Primero, realice una segunda inyección de 450 microlitros de solución de ajuste. A continuación, en la pestaña de parámetros, seleccione tiempo en el menú desplegable e ingrese cero en la ventana de inicio, 10 en la ventana de finalización, uno en la ventana de valor de paso y 200 en la ventana de estabilización.

Después de hacer clic en reproducir en la ventana de masas por lectura, utilice el cursor para leer el valor más alto para TM 1 69 o TB 1 59, y también el valor GD 1 55. A continuación, inyecte tres mililitros de agua Milli Q a través del bucle de muestra, seguido de 500 microlitros de solución de lavado DVS. En la pestaña de calibración de masas, haga clic en ejecutar para monitorear el progreso del lavado de limpieza hasta que la intensidad de las bandas comience a disminuir.

Luego, siga con tres mililitros de agua milicúbica y supervise hasta que las estelas disminuyan a niveles de fondo. Comience ingresando los isótopos de la muestra que se acaban de demostrar para los isótopos de la solución de calibración, y luego haga clic en guardar. A continuación, abra la ventana de adquisición y cambie la configuración de adquisición según sea necesario para el volumen de la muestra.

Por ejemplo, una muestra de 450 microlitros llenará el bucle de muestra y tardará 600 segundos en ejecutarse para permitir retrasos en la adquisición de los datos celulares. Establezca el retraso de adquisición en al menos 30 segundos y el retraso de estabilidad del detector en al menos 20 segundos antes de iniciar. Lave las muestras celulares al menos dos veces con agua Milli-Q y luego resuspenda la muestra a un máximo de 10⁶ células por mililitro y filtre la solución celular resultante a través de un tamiz celular de 35 micrómetros.

Para eliminar cualquier agregado. Ahora ingrese un nombre de archivo nuevo para la muestra actual. Tenga en cuenta que todos los archivos deben guardarse en la unidad E.

Luego cambie la válvula del bucle de muestra a carga, inyecte la muestra, vuelva a cambiar la válvula del bucle de muestra a inyección y haga clic en ejecutar. En la ventana de adquisición. Las células se representarán en la ventana de instantánea como agrupaciones horizontales de marcas en cada canal isotópico vertical y exhibirán la mejor resolución alrededor de 300 a 500 células por segundo, como se muestra aquí.

Cuando finalice la adquisición de datos de la muestra, aparecerá una ventana emergente. Haga clic en aceptar para confirmar la finalización del análisis de la muestra, y luego inyecte al menos 500 microlitros de agua MQ entre cada muestra para ayudar a minimizar cualquier arrastre de muestra y limpiar el equipo. Después de su uso, inyecte 450 microlitros de solución de lavado en el bucle de muestra. Supervise la liberación de metal libre y luego enjuague el bucle de muestra con tres mililitros de agua milli Q, monitoreando el lavado hasta alcanzar niveles de fondo de trazas.

Luego, para apagar la máquina, seleccione la pestaña del controlador RFG en la ventana de configuración del instrumento y haga clic en detener el plasma. Cuando el procedimiento esté completo, haga clic en aceptar en la ventana emergente, que recomienda la eliminación del nebulizador bajo la pestaña del bastidor de tarjetas. Apague el calentador, cierre la válvula del suministro de argón y luego tire cuidadosamente hacia atrás del nebulizador para retirarlo de la cámara de pulverización.

A continuación, desenrosque el tubo de introducción de la muestra y colóquelo aparte. Desenrosque la conexión de introducción del gas de arrastre hasta que se afloje ligeramente y luego retire el nebulizador. Finalmente, utilizando la misma jeringa y el mismo tubo que se mostraron anteriormente, limpie ambos orificios del nebulizador con Citron al 5 % y guarde el nebulizador cubierto con Citron al 5 % hasta su próximo uso.

El lavado adecuado del citómetro de masas con agua UE y solución de lavado DVS reducirá los niveles de absorción de metales en los tubos y otras partes del equipo, lo que ayuda a disminuir cualquier fondo, como se observa en estas gráficas. La sintonización inadecuada, representada por la línea magenta, aumentó significativamente la formación de óxidos en m más 16 en comparación con la muestra sintonizada correctamente, mostrada por la línea azul oscuro. Esto tiene como efecto una ligera disminución de las señales deseadas en m y un aumento significativo de la interferencia de fondo no deseada en m más 16.

El lavado adecuado y la dilución correcta de las muestras en agua Milli Q garantizarán un fondo mínimo y la mayor resolución de células, equilibrando al mismo tiempo la necesidad de rapidez. De forma similar a los datos de un experimento representativo mostrados aquí, en este experimento se analizaron en modo de adquisición celular microesferas de poliestireno que contenían lantano 139 ODIUM 140, terbio 159, DIUM 169 y lutecio 175 en abundancia natural. Los datos se analizaron utilizando FlowJo, y se excluyó mediante selección la basura procedente de microesferas rotas.

Se determinó que la muestra correctamente ajustada estaba en una velocidad de flujo de 0,74 litros por minuto, representada con la línea azul oscuro. Se observaron intensidades de señal más altas a esta velocidad de flujo que a velocidades de flujo más bajas, y se observó que esta muestra correctamente ajustada tenía una señal más alta en las masas metálicas M y una señal menor en las masas de óxido m más 16 que las señales incorrectamente ajustadas. Aquí se muestra un acercamiento de la señal en la masa M LANTANIO 1 39 y TULIO 1 69.

Tenga en cuenta que la velocidad de flujo del gas de compensación afecta más la intensidad de la señal del LANTANIO 1 39 que la intensidad de la señal del tulio 1 69. Estos gráficos muestran la señal en las masas óxido m + 16 de 1 55 y 180 5, correspondientes a los óxidos de LANTANIO 1 39 + OH 16 y tulio 1 69 + OH 16, respectivamente. Observe que la velocidad de flujo del gas de compensación aumenta mucho más la señal de la masa 1 55 que la señal de la masa 180 5, ya que el lantano 1 39 se oxida más fácilmente que el tulio 1 69.

Las intensidades de señal de m y m más 16 en función del caudal de gas de compensación se muestran aquí. Los iconos rellenos representan la masa M, mientras que los iconos vacíos representan la masa M más 16. Los colores de las líneas corresponden a la masa M respectiva. Obsérvese que las intensidades de señal de LANTHANUM 1 39 y PRICEDIUM 1 41 se ven altamente afectadas por el caudal del gas de compensación, llegando incluso a un punto en el que hay más óxido de masa M más 16 presente que la masa M. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo encender correctamente el CyTOF, sintonizarlo adecuadamente, analizar sus muestras y, finalmente, limpiar y apagar correctamente el equipo al final de sus análisis diarios.