Preparación de líneas celulares de Derribo condicional de la expresión génica y la medición de los efectos desmontables en la muerte celular inducida por E4orf4

El objetivo general del siguiente experimento es observar el efecto del silenciamiento de ACF uno o SNF dos H sobre la muerte celular inducida por E cuatro o cuatro. Esto se logra mediante la generación de líneas celulares en las cuales la expresión de ARNi de ACF uno o SNF dos H se activa condicionalmente mediante la adición de doxiciclina, lo que resulta en niveles reducidos de la proteína ACF uno o SNF dos H como segundo paso. Las células de las líneas celulares obtenidas se tratan con doxiciclina para reducir la expresión de ACF uno o SNF dos H o se dejan sin tratar.

A continuación, se expresa E cuatro o cuatro en células con o sin ACF uno o SNF dos H resistentes a S-H-R-N-A. Con el fin de investigar el efecto de ACF uno o SNF dos H sobre la muerte celular inducida por E cuatro o cuatro, se obtienen resultados que muestran el impacto de los niveles de ACF uno o SNF dos H en la toxicidad de E cuatro o cuatro, basados en el recuento de núcleos con morfología apoptótica mediante el ensayo JY. La ventaja principal de esta técnica frente a otros métodos, como la transfección transitoria de ARN, es que todas las células expresan el S-H-R-N-A y el porcentaje de células que coexpresan junto con el plásmido tradicional es mayor. Este método proporciona información sobre los mecanismos subyacentes a la muerte celular inducida por if 4 0 4, pero también puede aplicarse al estudio de otras proteínas proticas.

Además de Ana Lafe, un investigador de mi laboratorio demostrará partes de este procedimiento. Para comenzar el procedimiento de generación de líneas celulares inducibles, siembre células T-Rex 2 9 3 a una densidad de aproximadamente cinco veces 10 a la seis células por placa de 10 centímetros en ocho mililitros de DMEM que contenga suero sin tetraciclina y cinco microgramos por mililitro de blaster, y incube las placas durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, reemplace el medio con ocho mililitros de medio fresco antes de la transfección. El plásmido para la transfección es el plásmido P superior neo plus GFP que codifica ACF uno o SNF dos H-S-H-R-N-A, controlado por un promotor H uno inducible por tetraciclina, así como el gen de resistencia a la neomicina fusionado al GFP y controlado por un promotor PGK constitutivo.

Añada 10 microgramos de ADN plasmídico a 500 microlitros de cloruro de sodio 150 milimolar y vortexee. Luego, añada el reactivo jet PY a razón de dos microlitros por microgramo de ADN a otro tubo con 500 microlitros de cloruro de sodio 150 milimolar y vortexee. Añada la solución jet pie al ADN y mezcle bien mediante vortexeo.

Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de 15 minutos, pipetear suavemente los complejos de ADN sobre las placas de 10 centímetros que contienen una confluencia del 70 al 80%. Las células T-Rex 2 9 3 se mezclan al día siguiente.

Sustituya el medio por un medio selectivo, en este ejemplo DMEM como antes, que contenga 500 microgramos por mililitro de G cuatro 18. Durante las próximas dos semanas, supervise las células. Reemplace el medio selectivo por un medio fresco similar cada tres o cuatro días hasta que aparezcan colonias.

Identifique las colonias a simple vista y marque su ubicación en la parte inferior de la placa utilizando un marcador de color. Verifique bajo el microscopio que las colonias estén bien separadas. Las colonias pueden aislarse una vez que sean lo suficientemente grandes como para visualizarse sin microscopio.

Para el éxito de este procedimiento, es importante elegir colonias bien separadas durante el aislamiento de colonias. En una campana estéril, aspire el medio de la placa. Enjuague suavemente con PBS y aspire completamente todo el líquido restante.

Añada tres microlitros de trips al 0,25 % en EDTA a una colonia en la placa, pipeteando la trips repetidamente hasta que las células se desprendan de la placa. Transfiera las células a medio selectivo en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Repita esto con varias colonias adicionales en la placa.

Cultive las células a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono hasta que llenen el pocillo. Luego, divida las células de cada colonia original en tres pocillos cada una en una placa separada de 12 pocillos e incube durante la noche al día siguiente. Reemplace el medio en una placa con medio que contenga un microgramo por mililitro de doxiciclina a partir de una solución stock preparada en agua doblemente destilada.

Sustituya el medio en una placa de control con medio sin doxiciclina. Incube las células a 37 grados Celsius, 5 % dióxido de carbono durante 72 horas. Luego, se recolectan células de un pocillo tratado y uno no tratado para análisis por inmunotransferencia para determinar la eficiencia del silenciamiento de ACF uno o SNF dos H; aquí se muestra un resultado representativo.

Esta transferencia se tiñó con anticuerpos contra SNF dos H y alfa tubulina. Esta última sirve como control de carga para dos de los clones. Los clones número cuatro y número cinco mostraron una reducción marcada en SNF dos H tras la inducción con doxiciclina y, por lo tanto, se seleccionaron para su uso en el experimento de silenciamiento, que se demostrará en el siguiente segmento.

Las células no tratadas en la tercera placa se utilizarán para expandir la línea celular seleccionada y alícuotas de esas células se congelarán posteriormente. Para uso posterior para inducir el silenciamiento de ACF uno o SNF dos células H en medio selectivo en placas de 10 centímetros, añada doxiciclina a una concentración de un microgramo por mililitro a la mitad de las placas e incube a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas. Cada grupo de placas debe proporcionar células para 12 placas de seis centímetros, incluyendo dos réplicas para el ensayo de DPI para cada punto, así como una placa para el análisis por inmunotransferencia de cada muestra.

48 a 72 horas después de la inducción, retire las células de cada grupo mediante tripsinización y, tras contarlas, siembre 1,5 veces 10 a la seis células por placa de seis centímetros en el mismo medio con o sin doxiciclina. Incube las células a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono durante la noche; al día siguiente, transfecte las células según se indique.

Tanto las células no tratadas como las tratadas con doxiciclina se transfectan por triplicado de cuatro maneras distintas. Una con un plásmido vacío y un plásmido que expresa GFP, dos con el plásmido vacío así como un vector que expresa ACF uno resistente a SHRA GFP o SNF dos HGFP, tres con un plásmido que codifica E cuatro o cuatro y un plásmido que expresa GFP, y cuatro con el plásmido que codifica E cuatro, todos cuatro. Y el vector que expresa ACF uno resistente a SHRA GFP o SNF dos HGFP; tras la transfección, incubar todas las placas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante la noche.

Al día siguiente a la transfección de las células, extraiga proteínas de una placa por muestra para el análisis por inmunotransferencia (Western blot) con el fin de determinar que ACF uno o SNF dos H se ha silenciado eficientemente y que E cuatro o cuatro se expresó por igual en las diferentes muestras. Las 16 placas restantes se utilizarán para el ensayo DPI. Aspire el medio de las placas destinadas al ensayo DPI y lave suavemente las células con PBS en una campana química.

Añada un mililitro de paraformaldehído al 4% preparado en PBS para cubrir las células e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Aspire el paraformaldehído y lave con PBS agitando a temperatura ambiente durante cinco minutos. Repita el lavado dos veces más para un total de tres lavados; tras el tercer lavado con PBS, añada etanol al 80% conservado a menos 20 grados Celsius e incube a menos 20 grados Celsius durante al menos una hora.

Aspire el etanol y lave las células dos veces con PBS agitando a temperatura ambiente durante cinco minutos cada vez; después, lave una vez durante cinco minutos a temperatura ambiente con PBS que contenga 0,5 % de BSA y 0,05 % de Tween 20 o P-B-S-B-T. Realice también la agitación para prevenir la unión inespecífica de anticuerpos. Bloquee las células en un mililitro de tampón P-B-S-B-T que contenga 10 % de suero de cabra durante 20 minutos, agitando a temperatura ambiente.

Luego, lave las células dos veces en P-B-S-B-T durante cinco minutos por cada lavado. Incube las células con el anticuerpo primario, en este caso un anticuerpo específico para E cuatro o cuatro, en un mililitro de P-B-S-B-T durante una hora con agitación a temperatura ambiente. A continuación, lave dos veces en P-B-S-B-T y una vez en PBS que contenga 0,1 % de BSA, durante cinco minutos por cada lavado.

A continuación, añada a las células un mililitro de PBS con BSA al 0,1 % que contenga el anticuerpo secundario marcado con fluorocromo adecuado y 0,5 microgramos por mililitro. Incube durante 40 minutos con agitación a temperatura ambiente y en la oscuridad a la concentración final de DPI. Por último, lave con PBS durante cinco minutos.

Seque el pocillo mediante aspiración y mantenga las placas boca abajo durante una hora adicional hasta toda la noche para lograr un secado completo, y cúbralas con laminillas de montaje de aluminio sobre las células utilizando solución flora Mount G. Mantenga las placas a cuatro grados Celsius en la oscuridad hasta que estén listas para contar. Las células con núcleos apoptóticos que sufrieron los diversos tratamientos descritos en el protocolo fueron fijadas y teñidas con anticuerpos específicos E cuatro o cuatro y DPI para visualizar los núcleos de las células transfectadas.

Esta figura muestra un ejemplo de células que expresan E cuatro o cuatro y GFP. El panel A muestra la expresión del control de la proteína GFP por sí sola, y el panel B muestra la expresión de E cuatro o cuatro. Los núcleos teñidos con DAPI se muestran en el panel C y las imágenes fusionadas se muestran en el panel D. Las flechas blancas marcan células transfectadas con GFP y E. cuatro o cuatro que contienen núcleos con morfología apoptótica. Las flechas rojas marcan núcleos con formas irregulares que no se cuentan como núcleos apoptóticos. El asterisco marca núcleos mitóticos o núcleos que acaban de dividirse. El número de núcleos condensados o fragmentados visualizados mediante la tinción con DAPI se contó para calcular el porcentaje de núcleos con morfología apoptótica dentro de la población de células transfectadas, con el fin de mantener la objetividad óptima de la prueba.

El recuento de núcleos apoptóticos en las diversas muestras se realizó de forma ciega, en la que la persona que realizaba el recuento desconocía la identidad de las muestras. Se muestra un resultado representativo en esta gráfica. Se observaron porcentajes más altos de anomalías nucleares en células que expresan E cuatro o cuatro, lo que confirma que T cuatro o cuatro induce la muerte celular. El porcentaje más alto de anomalías nucleares se observó en células que expresan E cuatro o cuatro en las que los niveles de ACF uno se redujeron mediante un silenciamiento mediado por SHR y a, lo que indica que el agotamiento de ACF uno potencia la muerte celular inducida por E cuatro o cuatro y aumenta la toxicidad de E cuatro o cuatro en las células.

Expresar bajos niveles de ACF no se debió a un aumento en los niveles de E cuatro o cuatro, como se observa en el inmunotransferencia. Durante la realización de este procedimiento, es importante recordar facilitar un recuento adecuado de los núcleos apoptóticos con DPI y aplicar criterios estrictos para la identificación de estos núcleos. Además de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos clonogénicos, para validar los resultados del DA pse tras seguir este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como ensayos de co-inmunoprecipitación para responder preguntas adicionales. Por ejemplo, si existe una interacción física entre las proteínas estudiadas.