Ensayo Preferencia luz para estudiar innata y circadiano Photobehavior Regulado de Drosophila Las larvas

El objetivo general del siguiente experimento es probar el comportamiento fotográfico innato y circadiano de la lava de Drosophila mediante una prueba de preferencia por la luz y la oscuridad. Esto se logra criando primero las larvas experimentales en condiciones definidas de luz y oscuridad para establecer un reloj circadiano inicial en las larvas. A continuación, las larvas se cambian a oscuridad constante, lo que permite que el reloj circadiano de las larvas funcione libremente.

Una vez en la etapa de alimentación L tres, la lava se clasifica en grupos para probar su preferencia de luz en diferentes puntos de tiempo circadianos. Se obtienen resultados que muestran la preferencia lumínica innata y circadiana a partir del cálculo de un índice de preferencia y la comparación entre puntos temporales y grupos experimentales. Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación innata y circadiana de la detección de la luz y el procesamiento del comportamiento fotográfico, también se puede aplicar a otros sistemas como el olfato, la casación, la quimioterapia y los termotaxis.

Asimismo, se puede modificar para pruebas de aprendizaje y memoria. Para demostrar el procedimiento estará Alina y BMA Para los estudiantes graduados de mi laboratorio Para recolectar huevos, permitir que las moscas adultas en apareamiento pongan durante 12 horas en archivos frescos y transferirlos a nuevos viales. Siga transfiriendo a los adultos cada 12 horas para un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.

Mantenga las colecciones de huevos de 12 horas en la incubadora. Para el experimento, cría a los animales en la etapa temprana de larva L tres. Se trata de lactantes de alimentación disponibles de 84 a 108 horas desde el huevo.

La estadificación correcta de la LAE es fundamental para el éxito del experimento. Desde finales de L 3, LAE cambió el comportamiento de la foto para probar los componentes circadianos del comportamiento visual. 48 horas antes de la prueba y justo antes de que las larvas subjetivas, amanezca, coloque las larvas recolectadas en una caja de cartón.

Luego, transfiera la caja a una incubadora de oscuridad constante durante 48 horas hasta el experimento, estas larvas deben permanecer inalteradas en su espacio dedicado. Prepare la tapa de una placa de Petri de nueve centímetros usando un cuadrado de 20 centímetros dividido en cuatro cuadrantes. A modo de guía.

Pega cuadrados de 10 centímetros de papel de aluminio en los cuadrantes opuestos y cúbrelos con cinta adhesiva negra. Asegúrese de cubrir el borde de la tapa. A continuación, pegamento, un cuadrado de 20 centímetros dividido en cuatro cuadrantes debajo de la fuente de luz sobre la mesa.

Marque la circunferencia de una placa de prueba en la hoja para que actúe como guía para un desplazamiento constante. Instale una lámpara LED sobre la placa de Petri usando un soporte de hierro. Ajuste la altura de forma que toda la placa de prueba se ilumine de forma homogénea.

Ajuste la intensidad de la luz en un sitio de prueba a entre 350 y 760 luxe ajustando aún más la altura de la lámpara o utilizando una fuente de alimentación ajustable. La sala de experimentos necesita iluminación de luz roja y debe tener la misma temperatura que el lugar donde se crían los animales. Los frascos se mantuvieron dos días bajo una oscuridad constante.

Recoge la lava de su comida con una espátula de los cinco milímetros superiores de la comida. Extienda la comida en el lado exterior de la tapa de una placa de Petri. Agrega un poco de agua a la comida y mézclala suavemente con la espátula.

Agregue una gota de agua del grifo a un plato nuevo con un pincel. Transfiere las larvas a la gota de agua para lavarlas. Luego, use un pincel húmedo para recolectar las larvas con el pincel húmedo.

Seleccione solo las larvas L tres de alimentación temprana y evite las larvas L tres que deambulen tarde. Transfiera las larvas seleccionadas al centro de una placa de prueba. Alimentación L: tres larvas tienen esféricas anteriores que están abiertas y protuberantes hacia el exterior.

En forma de dedo. Las esféricas posteriores tienen tres aberturas cada una y cuatro grupos de grandes pelos ramificados. Las glándulas salivales se extienden hasta el segundo segmento abdominal.

Una vez que se hayan colocado 30 larvas en el centro de la placa de prueba, cúbrala con la tapa preparada. Encienda la lámpara LED. Inicie un temporizador y deje que las larvas se muevan libremente en el plato durante cinco minutos.

Luego retire rápidamente la tapa y cuente el número de larvas en la oscuridad y en los cuadrantes claros. Marcar la posición de cada lava puede facilitar el conteo. Una fotografía rápida también puede ayudar a que las larvas que muestran una preferencia por la luz poco clara, como las larvas que se arrastran por las paredes o las que toman prestado, se cuenten como preferencia neutra y se agreguen al número total de larvas cuando se calcule el índice de preferencia a la luz.

Después de contar las larvas, deseche la placa y use una nueva placa de prueba para el próximo experimento. Después de realizar de 10 a 15 ensayos por genotipo, proceda con el análisis siguiendo el protocolo. La preferencia por la luz y la oscuridad de la lava de Cantón ES se comparó en dos momentos circadianos diferentes.

CT cero y CT 12, subjetivamente, las larvas del amanecer y el anochecer gimen durante 48 horas en condiciones estándar y luego cambian a oscuridad constante durante tres días. Las pruebas de luz y oscuridad por debajo de 350 luxe revelaron que la fotosensibilidad a la luz fue mayor en las larvas probadas en CT cero en comparación con las larvas probadas en CT 12. Usando esta fórmula, la preferencia de oscuridad de la lava CT cero fue de 0,52 en comparación con 0,36.

Las larvas CT 12 que comparan los índices mediante una prueba de wilcoxon producen un valor significativo de P de 0,023. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo probar la preferencia de luz de la larva trofeo en diferentes circuitos y puntos de tiempo para este objetivo. Debería ser capaz de arrastrar en la etapa F a tres larvas oph, probar su comportamiento fotofóbico y calcular el índice de preferencia lumínica para la comparación estadística.