El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

El objetivo general de este procedimiento es aislar hepatocitos humanos mediante un procedimiento de perfusión de colagenasa en dos pasos. Esto se logra primero canulando los vasos sanguíneos en un trozo de hígado con cánula de irrigación. A esto le sigue la perfusión y digestión de la pieza hepática mediante colagenasa.

El tercer paso es la extracción de la cápsula brillante, que libera las células hepáticas disociadas. El paso final es una centrifugación a baja velocidad que aísla los hepatocitos. En última instancia, los hepatocitos se pueden identificar con microscopía de contraste de fase o mediante tinción de albúmina mediante inmunocitoquímica con viabilidad y rendimiento de hepatocitos determinados mediante un ensayo de exclusión de azul de triam.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de canulación y digestión son difíciles de aprender. Esto se debe a que la canulación requiere cierta delicadeza y la finalización de la digestión puede ser difícil de identificar. Para las personas nuevas en la técnica, la demostración del procedimiento estará a cargo de Natalie Lun, una técnica de mi laboratorio.

En esta demostración, usaremos un pedazo de hígado de lámpara en lugar de un pedazo de un humano, Configure el equipo para la perfusión de la pieza de hígado de la siguiente manera, ajuste el baño de agua a una temperatura adecuada de tal manera que las soluciones estén a 37 grados centígrados cuando lleguen al hígado. Pedazo. 41 grados Celsius es bueno para las soluciones uno, dos y tres, y para el condensador de vidrio encamisado, la solución cuatro, sin embargo, debe estar a 37 grados Celsius para reducir la pérdida de actividad de la colagenasa. Poco antes de la profusión, encienda el regulador de gas Para el aparato de oxigenación de un patólogo, obtenga una pieza de hígado que idealmente tenga una cápsula brillante casi o completamente intacta y solo un lugar de superficie cortada.

Esta pieza de hígado en el embudo de Buchner que contiene un disco de filtro perforado, el sistema de perfusión ahora debe cebarse con la solución uno utilizando una cánula de irrigación curva de inserto de bajo caudal con puntas de aceituna en los vasos sanguíneos más grandes en la superficie cortada de la pieza de hígado. A medida que la sangre sale del hígado, el tejido se vuelve más claro en las áreas con buena perfusión. El número de cánulas utilizadas varía para hígados de diferentes tamaños.

En general, se deben usar de cuatro a ocho cánulas para hígados que van desde menos de 20 gramos hasta más de 80 gramos. Seleccione el calibre de la cánula para que quede ajustada y segura. Deje los vasos sanguíneos más pequeños abiertos para que el tampón drene del tejido.

Ahora, aumente el caudal de la bomba peristáltica a entre 110 y 460 mililitros por minuto. Es una buena perfusión si la pieza de hígado es de un color más claro en todo el caudal utilizado. Depende del tamaño del hígado, y se utilizan tasas de perfusión más altas para hígados más grandes.

En términos generales, una velocidad de perfusión promedio de 44 mililitros por minuto por cánula es ideal en un rango de diferentes pesos hepáticos. El caudal elegido debe dar lugar a un ligero aumento de la pieza hepática. Mantenga la pieza de hígado húmeda durante la perfusión cubriéndola con un trozo de gasa empapada en solución salina.

Después de perfundir el tejido con un litro de solución, uno para eliminar cualquier resto de sangre en la pieza de hígado. Cambie el líquido de perfusión a la solución dos y perfunda durante 10 minutos. A continuación, cambie el líquido de perfusión a la solución tres y perfunde con medio litro.

Ahora cambie el líquido de perfusión a la solución cuatro, que contiene colagenasa. Llevar a cabo esta perfusión de forma recirculante durante nueve a 12 minutos o hasta que el hígado esté suficientemente digerido. Debe parecer que el tejido hepático se rompe ligeramente debajo de la cápsula brillante.

El hígado también debe sentirse reblandecido cuando se sondea con el lado romo de un bisturí. Es importante digerir la pieza de hígado durante la cantidad correcta de tiempo, ya que la digestión excesiva puede conducir a una baja viabilidad de los hepatocitos y la digestión insuficiente puede conducir a un bajo rendimiento de hepatocitos. Comience apagando la bomba peristáltica y retirando la cánula de la pieza hepática.

Luego coloque el tejido en un plato de cristalización que contenga de 100 a 200 mililitros de solución. Cinco. Retire la cápsula de brillos con cuidado y sacuda suavemente las células. Si hay regiones que no están bien perfundidas, se puede usar un bisturí para cortar estas regiones y liberar las células que contienen.

Agregue más solución cinco según sea necesario durante el proceso y, finalmente, lleve el volumen de solución cinco a 500 mililitros. Ahora filtre la suspensión de la celda dos veces. Primero, filtre las células a través de una malla de nailon de 210 micras en un matraz cónico de un litro.

Luego filtre las células a través de una malla de nailon de 70 micras en un matraz cónico de un litro. Vierta dos volúmenes iguales de la suspensión de la celda en tubos de centrífuga de 200 mililitros. A continuación, centrifugar la suspensión de células filtradas a 72 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Aspire el snat y vuelva a suspender suavemente el pellet de celda en unos 200 mililitros de solución. Cinco. Repita la centrifugación y la suspensión de resus tres veces después de la centrifugación final, resuspenda las células en una solución de almacenamiento en frío para obtener una concentración final de dos a 5 millones de hepatocitos por mililitro. Se puede utilizar un ensayo de azul de triam para medir con precisión el recuento de células mediante un hemocitómetro.

Aquí se muestran hepatocitos teñidos con azul de trian de 648 aislamientos. La viabilidad media de los hepatocitos humanos aislados fue de 77 más o menos 10%El rendimiento medio de los hepatocitos fue de 13 más o menos 11 millones de hepatocitos por gramo de hígado mediante inmunofluorescencia. Los hepatocitos aislados que se tiñeron positivamente para albúmina en verde tuvieron una pureza de 94 más o menos 1% para determinar la pureza de los hepatocitos.

La tinción inmunofluorescente se llevó a cabo cuatro veces con cinco repeticiones por ensayo. La microscopía de contraste de fase muestra las características morfológicas de los hepatocitos, como su gran tamaño celular y su forma poligonal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar hepatocitos humanos mediante un procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos.