VIGS mediada por delante de detección genética para la identificación de genes implicados en la resistencia no huésped

El objetivo general aquí es demostrar la metodología que utiliza el silenciamiento génico inducido por virus para identificar genes involucrados en la resistencia de no huéspedes para lograr VIG de la planta endógena. El gen objetivo inocula las plantas de nicotiana hamama con el virus del cascabel del tabaco que llevan un fragmento del gen objetivo, preparan e inoculan los cultivos de patógenos no huéspedes que expresan la proteína fluorescente verde en las hojas de la planta silenciadas por el gen. A continuación, evalúe las colonias fluorescentes verdes de patógenos no huéspedes bajo luz ultravioleta en la oscuridad.

Con el fin de identificar las plantas silenciadas por genes que comprometen la resistencia de los no huéspedes, identifique el gen objetivo secuenciando el inserto en el vector del virus. En general, esta metodología de cribado genético directo mediado por VIX permite a los investigadores identificar fácilmente los genes implicados en la resistencia de las plantas a los no huéspedes contra los patógenos bacterianos. En un corto período de tiempo, nos dimos cuenta de que la importancia de combinar el silenciamiento génico inducido por el virus mediaba por la genética directa con patógenos que expresan GFP UV para identificar los genes responsables de la resistencia no ST.

Cuando lo hacíamos anteriormente, un tedioso cribado genético directo mediante la puntuación de la hiperrespuesta inducía la muerte celular y la enfermedad inducía la muerte celular. Entonces, las semillas de nicotiana Ben en una mezcla para macetas sin tierra germinan las semillas en una cámara de crecimiento. Después de tres semanas, trasplante las plántulas a macetas individuales, cultívelas en un invernadero durante al menos dos o tres días antes de que aparezca el virus del cascabel del tabaco.

La inoculación del vector de higos descongela gradualmente los tallos congelados de agrobacterias que contienen los clones de ADNc. Intv dos vectores en condiciones estériles inoculan los cultivos individuales de agrobacterias en Luria. Las placas Berti agro incuban las placas a 28 grados centígrados durante un máximo de dos días.

Cultive cuatro colonias replicadas para cada clon de modo que se disponga de un inóculo de agrobacteria adecuado para la inoculación de dos plantas. Inocular TRV one en medio líquido Luria berti. Coseche los cultivos cultivados durante la noche por centrifugación, vuelva a suspender las bacterias en la inoculación, tampone e incube durante tres horas a temperatura ambiente en un agitador a 50 RPM.

Después de recolectar las células por centrifugación, mida la densidad óptica y vuelva a suspender los gránulos bacterianos en cinco milimolares MES tampón pH 5.5 A continuación, inocule el T RV un cultivo bacteriano con OD 600 de 0.3 en el lado del eje de tres a cuatro hojas de nicotiana hamama usando una jeringa sin aguja en el sitio de T RV una inoculación. Pinchar las hojas con el inóculo de las respectivas T RV dos colonias con un palillo de dientes durante dos semanas. Mantenga las plantas a baja temperatura con una nutrición adecuada, ya que el crecimiento vigoroso es importante para el silenciamiento eficiente de genes por parte de los cerdos.

A modo de ejemplo, en este experimento se utiliza el tomate T one de Pseudomonas Senge. Los patógenos deben portar un plásmido que pueda expresar G-F-P-U-V cultivar las cepas de PGE en reyes ser líquidos, medio suplementado con 10 microgramos por mililitro. La rifampicina de 50 microgramos por mililitro puede micina a 28 grados centígrados durante 12 horas.

Coseche los cultivos bacterianos por centrifugación, luego confirme la presencia de fluorescencia verde usando una lámpara UV de longitud de onda larga en la oscuridad. Después de dos lavados en agua estéril, suspenda las células a la concentración deseada de agua estéril y ajuste el diámetro exterior 600. A continuación, inocule los patógenos respectivos en el lado axial del objetivo.

Hojas silenciadas por genes de aproximadamente 1,5 centímetros de diámetro si es necesario. Pruebe simultáneamente varios patógenos no huéspedes para su crecimiento en el gen objetivo silenciado por las plantas, también incluye un control de vectores para su visualización. Implantar un crecimiento bacteriano entre dos y cinco días.

Exponga las hojas inoculadas a una luz ultravioleta de longitud de onda larga en la oscuridad. Asegúrese de usar protección para la piel y los ojos. Monitoree las colonias bacterianas como manchas verdes fluorescentes en el lado axial de la hoja en el fondo de fluorescencia roja emitida por la superficie de la hoja.

Verificar la fluorescencia verde emitida por el patógeno huésped que actúa como control positivo. Observe el crecimiento del patógeno diariamente de dos a cinco días después de la inoculación. Haga una lista de los clones que, silenciando, resultaron en el crecimiento de uno o más patógenos no huéspedes.

Para eliminar los falsos positivos de la primera pantalla. Repita los VIG para clones seleccionados y, de nuevo, pruebe la respuesta de las plantas silenciadas por genes a patógenos sin costo. Utilice la PCR de colonias en el clon seleccionado para amplificar la inserción utilizando el A TTB uno y un TB, dos cebadores en el T RV dos vectores o cebadores que borran el sitio de clonación.

Ejecute el producto de PCR en un gel aros y verifique la amplificación de la banda única. A continuación, secuencia la inserción del gen de la planta en el vector T RV dos utilizando los cebadores A TTB o los cebadores que flanquean el sitio de clonación. Realice la voladura utilizando la secuencia e identifique los detalles del gen.

Un protocolo generalizado para silenciar un gran número de genes utilizando higos basados en el virus del cascabel del tabaco en nicotiana. Hamana se muestra en este diagrama de flujo. Algunas de las plantas silenciadas por genes mostraron diversas alteraciones fenotípicas, incluyendo crecimiento atrofiado, fenotipos amarillentos y fotoblanqueadores.

Estos datos muestran la fluorescencia verde del patógeno expuesto a la luz ultravioleta en la oscuridad antes de la inoculación de la planta y sus implantes de crecimiento tres días después de la inoculación, la misma hoja expuesta a la luz blanca se muestra como control. Este experimento rastrea el crecimiento de bacterias que expresan G-F-P-U-V en plana. Tres no anfitriones.

Los patógenos se utilizaron para demostrar el proceso de identificación de la planta silenciada por genes susceptible a patógenos no hospedadores en las plantas de nicotiana hamama de tipo silvestre no silenciadas con inmunidad. Estos patógenos no crecieron. Sin embargo, al menos dos patógenos no hospedadores crecieron en

las hojas silenciadas del gen NB sgt.One. Los datos cuantitativos sobre el crecimiento bacteriano demuestran el proceso de identificación de plantas silenciadas por genes comprometidos por la resistencia no ST. Utilizando este enfoque de genética avanzada mediada por higos, hemos silenciado alrededor de 5.000 genes en nicotiana hamana e identificado plantas que comprometen la resistencia no ST durante un período de aproximadamente un año y medio.

A modo de ejemplo, aquí se muestra el crecimiento de patógenos no hospedadores en dos plantas silenciadas por genes identificadas a partir de esta pantalla. Esperamos haber transmitido cómo realizar el silenciamiento génico inducido por virus para cientos de genes, y luego evaluar las plantas silenciadas mediante la observación del crecimiento de patógenos sin costo en plana para diseccionar la resistencia sin costo. Mediante el uso de este gen inducido por el virus, el protocolo mediado por silenciamiento, se puede silenciar cientos de genes en un período de tiempo de aproximadamente dos a tres semanas, y luego evaluar el crecimiento de patógenos no equinos marcados con GFP UV en aproximadamente dos o tres horas al día, que abarcan alrededor de dos a cinco días.