Juxtasomal Biocitina Etiquetado para estudiar la estructura-función de la relación de un individuo neuronas corticales

El objetivo general de este procedimiento es vincular el aumento del potencial de acción específico del tipo de célula en la corteza sensorial durante el procesamiento de la información con la identidad morfológica de las neuronas registradas. Esto se logra primero preparando quirúrgicamente a la rata para las grabaciones somales yuxtas. Una vez preparado, un electrodo registra la actividad de aumento espontánea y sensorial evocada, y la neurona registrada se carga con biocidina mediante corriente e inyecciones.

Después, el cerebro se procesa para la tinción de biotina. Finalmente, la neurona llena de biotina se reconstruye digitalmente a partir de secciones posteriores para la clasificación del tipo de célula. En última instancia, las grabaciones yuxtasomales de neuronas individuales permiten el estudio del procesamiento sensorial y la información estructural dentro de la red cortical.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia, como ¿cuál es el papel de los tipos y capas de células individuales durante el procesamiento sensorial? Por lo general, las personas que necesitan este método tendrán dificultades porque es muy fácil matar las neuronas durante el procedimiento de relleno. Las posibilidades de éxito en el llenado de biocidina aumentan mediante la preparación de pipetas de óptima calidad y, además, es necesario un ojo entrenado para controlar las inyecciones de corriente de banda estrecha.

Por lo tanto, se necesita experiencia para aumentar la tasa de éxito de la recuperación de neuronas bien llenas. Para empezar, coloque una rata wistar anestesiada en un marco estereotáxico equipado con una almohadilla térmica. Confirme la profundidad de la sedación probando el reflejo de pellizco de los dedos de los pies.

A continuación, inserte una sonda rectal para mantener la temperatura corporal correcta. Asegure la cabeza del animal y retire el pelo del sitio quirúrgico. Aplique ungüento en los ojos para prevenir la sequedad.

Espere de tres a cinco minutos después de inyectar lidocaína en el sitio de la operación y retire la piel que cubre la superficie del cráneo. A continuación, elimine cualquier tejido restante y limpie el cráneo ampliamente con cloruro de sodio al 0,9%. Determine las coordenadas de la corteza somatosensorial primaria en el hemisferio izquierdo y marque la ubicación en el cráneo con un rotulador cutáneo quirúrgico.

Use un taladro dental para raspar el hueso de la región de interés. Continúe raspando el hueso hasta que se vuelva transparente y los vasos sanguíneos sean claramente visibles. A continuación, corta una pequeña ventana en el cráneo delgado con un bisturí.

Teniendo cuidado de no dañar la duramadre y los vasos sanguíneos. Marque los bordes de la craneotomía con un rotulador cutáneo quirúrgico. Para mejorar la visibilidad, aplique una capa delgada de superpegamento sobre el cráneo seco y luego cemento dental para construir un baño.

Al cerrar la craneotomía, recorte los bigotes del lado contralateral a exactamente cinco milímetros para ayudar a su visibilidad. Resalte los bigotes recortados con rímel negro antes de comenzar las grabaciones, haga pipetas de parche de vidrio Boro Silicic. La morfología ideal de la pipeta es un cono delgado gradual, un ángulo de cono bajo y un diámetro interior de la punta de aproximadamente una micra.

Cargue la pipeta de parche con un timbre de radiación normal, complementado con un 2 % de biotina, y monte la pipeta de parche en un soporte de pipeta, fijado a una platina de cabeza y conectado a un manipulador de micrómetros. Para apuntar específicamente a la columna D dos de rata S uno, ajuste el ángulo del portaelectrodos a 34 grados con respecto al plano sagital. A continuación, coloque la pipeta de parche muy cerca de la craneotomía.

Llene el baño con cloruro de sodio al 0,9%. Con el amplificador en modo puente, aplique pulsos cuadrados con inyección de corriente positiva para determinar la resistencia del electrodo. La resistencia óptima del electrodo se encuentra entre tres y cinco megas.

Establezca una sobrepresión de 100 a 150 milibares y avance la pipeta de parche en pasos de una micra mientras aplica corriente positiva en forma de pulsos cuadrados. Controle el cambio de resistencia robusto al establecer contacto con la duramadre. En este punto, establezca las coordenadas del micromanipulador en cero para permitir mediciones de profundidad precisas.

Avance en el modo de paso de una micra hasta que la pipeta de parche penetre en la duramadre, lo que se indica por una caída repentina de la resistencia del electrodo. Retire la presión de retención de la pipeta. A continuación, busque unidades individuales mientras avanza en pasos de una micra.

Monitoree la resistencia del electrodo continuamente mediante la aplicación de pulsos de encendido y apagado de 200 milisegundos y el aumento en la resistencia del electrodo generalmente indica la proximidad de una sola neurona para avanzar el electrodo hasta una acción de marcha positiva. Se registran formas de onda potenciales de aproximadamente dos milivoltios. Opcionalmente, registre la actividad de aumento espontáneo y determine la actividad de aumento revocada de los bigotes desviando codiciosamente los bigotes individuales con un dispositivo eléctrico de pizo para obtener las condiciones óptimas para el llenado somal yuxta.

Haga avanzar el electrodo hasta que la resistencia sea de 25 a 35. Los mega ohmios y los picos tienen amplitudes de tres a ocho milivoltios para iniciar el llenado somal yuxta. Aplique pulsos de corriente cuadrada positiva a partir de un nano amperio.

Aumente lenta y gradualmente la corriente en pasos de 0.1 nano amperios mientras monitorea la forma de onda y la frecuencia AP. Monitoree la apertura de la membrana como un claro aumento en la frecuencia AP durante la fase de encendido del pulso de bloque, la forma de onda del pico durante el llenado muestra un aumento de ancho y se reduce después de la hiperpolarización, aumente o disminuya la corriente mientras se llena para mantener una infusión de biotina estable, reduzca o detenga los pulsos de corriente ante un aumento repentino de la frecuencia AP. Para evitar la toxicidad por afluencia excesiva de iones extracelulares como los iones de sodio.

Es importante tener en cuenta que cada neurona responderá de manera diferente al procedimiento de llenado. Por lo tanto, los parámetros de etiquetado somal yuxta deben ajustarse en función de las condiciones de grabación. Monitoree de cerca la señal después de detener la inyección de corriente.

La forma de onda de pico después de una sesión de llenado generalmente se ensancha y muestra una espera fuertemente reducida después de la hiperpolarización para la recuperación de la neurona, que es evidente cuando la forma de onda de pico vuelve a sus propiedades originales para reducir cualquier estrés mecánico a la célula. Retraiga la pipeta de parche en pasos de una micra hasta que la amplitud de la espiga disminuya, espere al menos una hora para que la biotina se difunda intracelularmente mientras controla de cerca la temperatura corporal y la respiración del animal. Finalmente, se obtienen muestras de cerebro y se procesan para revelar la calidad del marcaje yuxta somal.

Estas imágenes muestran imágenes de neuronas llenas de yuxta malicia en la corteza somatosensorial primaria. Esta vista tangencial de una neurona parametálica demuestra la diferencia de tamaño entre las dendritas y los axones. En esta reconstrucción digital de una neurona marcada con yuxta somalí, la imagen de proyección de la neurona se muestra a alta resolución, pero con bajo aumento, y con la reconstrucción digital automatizada superpuesta con el axón en azul y la dendrita en rojo respectivamente.

Aquí, la región de la caja se expande para mostrar el axón bhuton a lo largo de la longitud del axón. En esta animación final, ejemplificamos la tubería de reconstrucción para una neurona parametálica con mechones gruesos de la corteza somatosensorial primaria de rata. La tubería implica la reconstrucción de la morfología dendrítica y axonal con un aumento de 100 veces y los contornos del barril con cuatro aumentos de aumento.

El resultado es una reconstrucción 3D completa, que posteriormente se registra en un marco de referencia estandarizado para realizar un análisis cuantitativo de las características morfológicas. Por lo tanto, el marcaje somal yuxta, in vivo, permite una calidad de etiquetado excepcional para una reconstrucción fiable de la morfología 3D completa. Aquí mostramos el método en animales anestesiados con uretano.

Sin embargo, las grabaciones de Jux Somal también se pueden utilizar en animales despiertos con la cabeza restringida para estudiar el papel de los tipos de células individuales y las capas durante la exploración activa del medio ambiente. Después de ver este video, debería tener una mejor comprensión de cómo realizar el etiquetado de biocida en neuronas individuales para la identificación y reconstrucción morfológica posteriores a la guerra.