Un protocolo para el análisis de la hepatitis C de replicación del virus

El objetivo general de este procedimiento es investigar diversas etapas del ciclo de replicación del virus de la hepatitis C. Esto se logra primero generando transcritos de ARN genómico del VHC a partir de constructos de plásmidos linealizados del VHC. El segundo paso consiste en transfectar las células con ARN del VHC. A continuación, las células se siembran para diferentes puntos temporales y ensayos. El paso final es recoger el sobrenadante del cultivo celular para medir el título viral y cosechar las células transfectadas para obtener proteínas y ARN. Finalmente, se realizan la transcripción inversa-PCR, el inmunoblot Western, el ensayo de inmunofluorescencia y la determinación del título del VHC, lo que demuestra un sistema robusto de cultivo celular infeccioso por VHC.

La principal ventaja de este sistema de cultivo celular de virus de hepatitis C infeccioso frente al sistema de replicón del VHC es que permite investigar los pasos de entrada viral, ensamblaje de viriones y salida. Este protocolo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la virología de la hepatitis C, como la morfogénesis de viriones y la interacción entre el patógeno y el huésped. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de vacunas, ya que permite la caracterización de cepas virales atenuadas que pueden evaluarse como candidatas potenciales a vacuna.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el virus de la hepatitis C, también puede aplicarse a otros virus de ARN de la familia Flaviviridae. En general, las personas nuevas en este método se enfrentarán al reto de generar ARN genómico de alta calidad del VHC. El estudio del ciclo de replicación completo del VHC se volvió factible en cultivo celular tras el descubrimiento de un aislado japonés del VHC de hepatitis fulminante genotipo-2A. La demostración visual del ensayo virológico es fundamental porque el ensayo requerirá experiencia tanto en técnicas moleculares como celulares.

Utilizando un virus quimérico intra-genotipo 2A, F-N-X-H-C-V y F-N-X-H-C-V con polimerasa nula para la evaluación de la replicación viral, linearice los plásmidos virales generados previamente mediante digestión con la enzima de restricción XBA-uno en un tubo de dos mililitros. Luego, trate los plásmidos con nucleasa de mung bean para generar extremos romos.

Purifique los plásmidos digeridos mediante cromatografía de intercambio aniónico. Verifique la integridad del plásmido linealizado sometiendo el ADN a electroforesis en gel de agarosa. A continuación, agregue la plantilla de ADN del plásmido linealizado a un tubo de 0,2 mililitros que contenga los componentes de la reacción de la ARN polimerasa T-siete para sintetizar transcritos de ARN genómico del VHC.

Purifique el ARN recién sintetizado tratado con DNasa utilizando un kit de purificación de ARN. Luego, verifique la producción de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa. A continuación, cuantifique el ARN mediante espectrofotometría.

Desprenda las células adherentes basadas en Huh-7 mediante tratamiento con enzima tripsina y recolecte las células en un tubo cónico de 50 mililitros. Tras dos centrifugaciones posteriores, re suspenda el sedimento celular con medio frío de bajo suero. Después de repetir la centrifugación, re suspenda las células en medio de bajo suero a una concentración de un por diez elevado a siete células por mililitro.

A continuación, mezcle un total de 10 microgramos de ARN viral transcrito con 400 microlitros de células resuspendidas en una cubeta de electroforesis preenfriada de 0,4 centímetros. Introduzca el ARN viral en las células mediante una electroforesis a 270 voltios, 100 ohmios y 950 microfaradios. Una vez finalizado, resuspenda las células electroporadas en 10 mililitros de medio de crecimiento completo con 15 %FBS. En este momento, siembre las células en matraces T25 a aproximadamente 1,2 × 10⁶ células por matraz y en placas de 48 pozos a 1 × 10⁴ células por pozo para puntos temporales de 4, 48 y 96 horas. Reemplace el medio entre cuatro y ocho horas posteriores a la transfección con medio de crecimiento fresco suplementado con 10 %FBS para eliminar los restos de células muertas de los matraces y placas cultivados.

Mediante una pipeta serológica, recolecte los sobrenadantes del cultivo celular en los momentos de 48 y 96 horas en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, elimine los restos celulares de las muestras recolectadas mediante centrifugación a 15.000 rpm durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, almacene los sobrenadantes libres de células a 80 grados Celsius negativos.

Lise las células para análisis de proteínas y ARN mediante blot de Western y PCR cuantitativa de transcripción reversa o RT-qPCR en los puntos de tiempo indicados. Transcriba a ADN complementario un microgramo de ARN celular total utilizando la enzima transcriptasa reversa y un cebador específico para la hebra sentido del VHC que se une a la región no traducida cinco prima en un tubo de 0,2 mililitros. Asimismo, transcriba a ADN complementario F-N-X-H-C-V-R-N-A con copias genómicas conocidas utilizando un cebador de la hebra sentido del VHC. Mediante un sistema de PCR en tiempo real, realice la qPCR utilizando 50 nanogramos del ADNc transcrito resultante, cebadores específicos para el VHC y una mezcla sobrante para qPCR que contenga un colorante verde de unión al ADN. Utilice las siguientes condiciones al realizar la qPCR para determinar el número de copias de R-N-A del V-H-C. Tras la qPCR, resuelva el lisado celular proveniente del ARN viral transfectado a 96 horas posteriores a la transfección mediante electroforesis SDS-PAGE. Luego, transfiera las proteínas resueltas en el gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno mediante el método trans-blot turbo. Bloquee la membrana utilizando una solución bloqueadora que contenga leche descremada al 5 % y tween-20 al 0,2 % en PBS y colóquela en un recipiente.

Incube la membrana con el anticuerpo primario monoclonal de ratón NS3 a una dilución de uno a 1000 y con beta-actina a una dilución de uno a 5,000 en una cámara fría a cuatro grados Celsius. Después de la incubación, agregue inmunoglobulina G de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante a una dilución de uno a 5,000 y detecte mediante quimioluminiscencia.

En este punto, fije las células transfectadas con H-C-V-R-N-A utilizando metanol durante 30 minutos a veinte grados Celsius bajo cero para el ensayo de inmunofluorescencia. Una vez finalizado, lave las células tres veces con PBS. Después de bloquear con tampón de bloqueo para el ensayo de inmunofluorescencia, use el anticuerpo primario anti-NS5A policlonal de conejo y el anticuerpo primario anti-DSRNA monoclonal de ratón J2 en una dilución de uno a 200 e incube durante cinco horas hasta toda la noche en una cámara fría a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, lave las células tres veces con PBS después del anticuerpo primario. Luego agregue el anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-inmunoglobulina G 488 de conejo y el anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-inmunoglobulina 594 de ratón en una dilución de uno a 1000 e incube durante una hora a temperatura ambiente en un agitador rotatorio de mesa. Después de lavar las células tres veces con PBS, tiña los núcleos utilizando el colorante Hoechst y observe mediante un microscopio de fluorescencia.

A continuación, siembre células Huh7.5.1 naïve a aproximadamente tres veces 10 a la tercera células por pocillo utilizando una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, realice una dilución seriada decimal del sobrenadante de cultivo libre de células obtenido de células transfectadas con ARN de H-C-V, utilizando medio de crecimiento, e inocule en triplicado sobre células Huh7.5.1. Fije las células a las 72 horas post-infección usando metanol durante 30 minutos a 20 grados Celsius negativos. Después de retirar las células del congelador, realice tinción inmunofluorescente para la proteína NS5A del H-C-V en condiciones previamente descritas. Utilizando un microscopio de fluorescencia, cuente los focos celulares positivos para NS5A en el pocillo con la mayor dilución viral y calcule el número promedio de unidades formadoras de focos por mililitro.

La calidad del plásmido linealizado del VHC se evaluó mediante electroforesis en gel. El ADN del VHC se sometió a transcripción in vitro mediada por la ARN polimerasa T7, lo que produjo un único producto de ARN de 9,6 kilobases. Los resultados de RT-qPCR indicaron que el virus silvestre replicó el genoma de manera eficiente. El tipo silvestre mostró un nivel de replicación del genoma de uno a tres órdenes de magnitud superior en comparación con el virus pol-nulo.

El virus de tipo salvaje produjo la proteína NS3 implicada en la escisión de proteínas virales y en la replicación del genoma. El virus de tipo salvaje también expresó la proteína NS5A, y la proteína NS5A y el ARN de doble cadena se co-localizaron en el citoplasma celular de las células transfectadas con el tipo salvaje, lo que sugiere una replicación viral activa. Las mediciones del título viral indicaron que el virus de tipo salvaje es infeccioso y produce más de 10.000 unidades formadoras de focos por mililitro de partículas infecciosas. A las seis horas posteriores a la transfección, tanto el virus de tipo salvaje como el virus pol-nulo presentaron actividades de luciferasa similares, lo que indica que se había traducido un nivel similar de ARN transfectado. Sin embargo, a las 48 y 96 horas posteriores a la transfección, el virus de tipo salvaje mostró niveles aumentados de replicación del genoma en comparación con el virus pol-nulo. El virus de tipo salvaje también produjo la proteína viral NS3. El virus pol-nulo presentó una actividad de luciferasa basal, mientras que el virus de tipo salvaje mostró un nivel de replicación dos a tres órdenes de magnitud mayor en comparación con el virus reportero pol-nulo. Una vez dominadas, las pruebas virológicas del virus de la hepatitis C pueden realizarse en dos semanas si se llevan a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante contar con células robustas y transcritos de ARN genómico de VHC de alta calidad. Tras seguir este procedimiento, se pueden probar cepas de VHC caracterizadas en sistemas de modelos animales para investigar la aptitud in vivo y las interacciones huésped-patógeno.

El desarrollo de un sistema de cultivo celular infeccioso para el VHC allanó el camino para que los investigadores exploraran los pasos de morfogénesis del virión y salida viral en el ciclo de replicación del VHC. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar diversos ensayos virológicos para caracterizar las diferentes etapas del ciclo de replicación del virus de la hepatitis C. No olvide que trabajar con el virus de la hepatitis C puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones de seguridad, como el uso de equipo de protección personal adecuado, durante la realización de este procedimiento.