El aislamiento de los pequeños RNAs no codificantes de suero humano

El objetivo general de este procedimiento es aislar ARN de alta calidad de muestras de suero. Usando nuestra versión optimizada del protocolo RTLS de reactivo MRC común. Esto se logra diluyendo primero el suero en una proporción de uno a cinco con agua libre de nucleasa para reducir la contaminación de proteínas.

El segundo paso es introducir dos tubos de bloqueo de fase de mililitros para el primer paso de centrifugación. Esto atrapa la mayoría de los contaminantes, como el fenol y las proteínas, en la fase orgánica. A continuación, el tercer y último paso de optimización es el centrifugado instantáneo a 12.000 quesos, que elimina cualquier contaminación residual de la pelliza de ARN antes de los lavados con etanol.

El paso final es agrupar dos preparaciones de ARN modificado del mismo paciente si se requiere un mayor rendimiento de ARN total. En última instancia, mediante el uso de este método modificado, que solubiliza el suero en agua libre de nucleasas, emplea un tubo de bloqueo de fase para atrapar los contaminantes principales e introduce un espín repentino. Demostramos que es posible maximizar la recuperación de pequeños ARN no reconstituyentes a partir de un aislamiento de ARN del suero.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el protocolo estándar de aislamiento de ARN triol, es que a través de modificaciones simples, podemos maximizar el rendimiento de ARN del suero. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los ARN pequeños se encuentran en bajas cantidades en el suero. El método optimizado y la visualización de estos pasos mejorarán la recuperación de estos ARN y guiarán a los novatos hacia un diagnóstico de aislamiento exitoso.

Para comenzar, descongele la muestra de suero congelado previamente preparada en hielo, luego transfiera 400 microlitros del suero recién descongelado a un tubo de microcentrífuga etiquetado. A continuación, diluir el suero con 100 microlitros de agua libre de R nase y añadir 50 microlitros de proteinasa K a una concentración de un miligramo por mililitro. A continuación, incubar el suero diluido a 37 grados centígrados durante 20 minutos para permitir una digestión adecuada de las proteínas y garantizar una solubilización completa a 1,5 mililitros de tri reactivo RTLS y 100 microlitros de cuatro promo anole.

Invierta brevemente el homogeneizado y realice un pipeteo repetitivo durante cinco segundos. Luego, transfiera la mezcla a un tubo de bloqueo de fase pesado de dos mililitros etiquetado. Centrifugar el homogeneizado a 12.000 GS durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, decanta cuidadosamente un mililitro de la solución acuosa resultante en un tubo fresco de ADN de baja unión. El orgánico y la interfaz deben quedar atrapados debajo del gel blanco del tubo de bloqueo de fase. A continuación, añada cinco microlitros de glucógeno y 500 microlitros de isopropanol al 100% a la solución acuosa.

Mezcle la solución por inversión e incube durante la noche a menos 20 grados centígrados. Después de la incubación durante la noche, centrifugar la muestra durante 20 minutos a 12.000 GS en una centrífuga de cuatro grados centígrados. A continuación, deseche el sobrenadante transparente y realice un centrifugado rápido durante dos minutos a 16.000 GS en una centrífuga de cuatro grados centígrados.

Con una pipeta, retire con cuidado la solución transparente que rodea el pellet. A continuación, lavar el pellet con un mililitro de etanol al 70% y centrifugar la muestra a 10.000 GS durante 10 minutos. Para visualizar el pellet, incline el tubo frente a un fondo oscuro y retire la solución de lavado.

Repite el lavado. Aumentar. Suspendemos el pellet en 10 microlitros de agua libre de ARN.

Asegúrese de que el pellet se disuelva por completo calentando la muestra a 55 grados centígrados durante cinco minutos. Durante este tiempo, mezcle la muestra con pipeteo repetido para obtener un mayor rendimiento total de ARN, dos preparaciones de ARN del mismo paciente. Cuantifique el ARN resuspendido utilizando un

espectrofotómetro UV frente a un espectrofotómetro y evalúe la calidad del ARN utilizando un bioanalizador 2100. A continuación, almacene las muestras de ARN agrupadas a menos 80 grados centígrados para su uso en aplicaciones posteriores. Los espectros fotométricos de los perfiles de ARN del suero humano demuestran la mejora del rendimiento del ARN debido a la adición de varios pasos al enfoque tradicional de Chomsky.

Un perfil UV típico de ARN aislado del suero humano contrasta con los que utilizan pasos de optimización, incluida la adición de glucógeno y espín adicional, y cada una de esas herramientas combinadas da como resultado una reducción de contaminantes y un mayor rendimiento total de ARN. La pureza de la muestra de ARN se incrementó aún más con el uso de un gel de bloqueo de fase, que atrapa el fenol y las proteínas. Además, el aumento del volumen de suero tiene un impacto notable en la producción de ARN.

Se realizó un rastreo con bioanalizador para analizar más a fondo la calidad de la muestra. Un solo pico en aproximadamente 21 nucleótidos representa el perfil de la matriz de fracciones de micro ARN y la QPCR se realizaron siguiendo el procedimiento. Este perfil de matriz de tres cánceres de cabeza y cuello y un S normal muestra la expresión de microRNAs, analizados mediante agrupamiento jerárquico y presentados como un mapa de calor donde se puede ver la regulación positiva y negativa de los microRNAs.

Siguiendo la QPCR, se generaron curvas de amplificación para microRNAs específicos. Estos datos se utilizaron para trazar los valores brutos de TC para el suero normal Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cualquier número de pacientes produciendo ARN de alta calidad en el máximo actual si se realiza correctamente después del procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la PCR cuantitativa o la secuenciación de nueva generación, para responder a preguntas adicionales, como el descubrimiento y la validación de biomarcadores.