Desde Voxels al Conocimiento: Una Guía Práctica para la segmentación del Complejo Microscopía Electrónica 3D-Data

El objetivo general del siguiente experimento es segmentar las características de interés de conjuntos complejos de datos de microscopía electrónica 3D de células y tejidos para el análisis de su organización 3D. Esto se logra mediante la recopilación de un conjunto de datos que consta de imágenes individuales de microscopía electrónica. A continuación, los datos 2D sin procesar se reconstruyen en un volumen 3D y se filtran para reducir el ruido y mejorar las características de interés. Como segundo paso, se evalúan las características objetivas y subjetivas de los datos para informar la mejor elección de método para la segmentación.

A continuación, ya sea abstraído manual, generación de modelos, trazado manual de características de interés. Se realiza una segmentación automatizada basada en la densidad o una segmentación automatizada personalizada para extraer las características de interés. Los resultados muestran modelos finales segmentados en 3D de características de interés basados en la clasificación de las características de la imagen y los objetivos personales para elegir el enfoque de segmentación óptimo.

Una comparación entre los diferentes enfoques para los diferentes conjuntos de datos ayudará a seleccionar la estrategia de segmentación correcta. Demostramos diferentes métodos para la extracción de características de interés. Dada la complejidad de los volúmenes de electromicroscopía subcelular, cada enfoque tiene sus ventajas y limitaciones.

Por lo general, las personas nuevas en la segmentación pueden tener dificultades porque no siempre está claro identificar el mejor enfoque para los diferentes conjuntos de datos. Junto con el desahogo de los estudiantes de posgrado. Tai que demuestre el procedimiento será BU como postdoc de coche.

En mi laboratorio, Amit Hassan, investigador asociado en mi laboratorio y Joaquin Korea, ingeniero de sistemas informáticos en mi laboratorio La generación manual de modelos abstractos se utiliza cuando el único objetivo es crear un modelo geométrico para realizar mediciones geométricas. Para empezar, importe el volumen de datos en un programa adecuado. Para la generación manual de modelos abstractos, en esta demostración se utiliza el software kymera.

Primero seleccione el archivo y ábralo para abrir el cuadro de diálogo de abrir archivo, navegue hasta la ubicación del archivo del mapa deseado. A continuación, abra el visor de volumen y seleccione el estilo de visualización de características para mostrar datos con diferentes estilos de representación. Ajuste el umbral de la visualización arrastrando la barra vertical del histograma en la ventana del visor de volumen.

Navegue por el volumen 3D para seleccionar un área de interés para la segmentación y recorte un subvolumen más pequeño si es necesario. En el cuadro de diálogo del visor de volúmenes, seleccione entidades, selección de subregiones, haga clic y arrastre para crear un cuadro rectangular alrededor de la región de interés. A continuación, coloque marcadores a lo largo de la entidad de interés y conéctelos con los vinculadores cuando corresponda hasta que se complete el modelo.

Para lograr esto, en la barra de menú del visor de volumen, seleccione herramientas, cuadro de diálogo del rastreador de volumen. Para abrir el cuadro de diálogo del rastreador de volumen allí, seleccione archivo, nuevo marcador. Poner. En el cuadro de diálogo del trazador de volumen, marque el ratón, coloque marcadores en alta densidad, coloque marcadores en datos, planos de movimiento e iz, marcadores que vinculen el nuevo marcador al marcador seleccionado y que vinculen marcadores seleccionados consecutivamente.

A continuación, en la ventana del rastreador de volumen, seleccione colocar marcadores con el botón derecho del ratón e inserte los radios de los marcadores y enlaces. A continuación, haga clic con el botón derecho en los datos de volumen para comenzar a establecer marcadores. Los marcadores se conectarán automáticamente en el cuadro de diálogo del rastreador de volumen.

Seleccione el archivo, guarde el marcador actual. Establezca el marcador de cierre de archivo. Poner. Abra un nuevo conjunto de marcadores para comenzar a construir un modelo en una segunda característica de interés deseada.

Utilice colores contrastantes entre conjuntos de marcadores para enfatizar las diferencias en las entidades. El rastreo manual de características de interés es un enfoque que requiere mucho tiempo y se utiliza cuando la densidad de población es relativamente pequeña y cuando la precisión de la extracción de características es primordial. Para comenzar a importar datos de volumen en un programa con opciones de seguimiento manual. Software.

Con esta capacidad generalmente ofrecemos una herramienta básica de pincel. En esta demostración, se utiliza el software Amira para tomos grandes. Seleccione datos abiertos y haga clic con el botón derecho en el nombre de archivo rec.

A continuación, haga clic en formatear, seleccione sin procesar como datos de disco grandes. Bien, y carga. Seleccione los parámetros de datos sin procesar apropiados de la información del encabezado y haga clic en Aceptar.

Alterne y guarde como un nuevo nombre de archivo. am file. Para la secuencia de imágenes 3D, seleccione datos abiertos y seleccione el nombre de archivo tiff o el nombre de archivo dot mrmc.

Luego alterne, haga clic derecho y seleccione guardar como nombre de archivo am. En la ventana del visor 3D, seleccione corte ortogonal para abrir el archivo de imagen. A continuación, utilice un control deslizante en la parte inferior para navegar por los segmentos y recortar los datos más grandes abiertos como datos de disco grandes.

Cambie el nombre del archivo en la ventana del grupo, haga clic con el botón derecho y seleccione el acceso a la celosía. Introduzca el tamaño de caja deseado, mueva la caja al área deseada y haga clic en aplicar. Guarde el nuevo archivo.

A continuación, cree un archivo de segmentación alternando el archivo en la ventana del grupo. A continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione el campo de etiqueta de etiquetado. Se creará un nuevo archivo y se cargará automáticamente en la pestaña del editor de segmentación, así como en el grupo de objetos.

Utilice la herramienta Pincel para trazar el borde de la primera entidad de interés. Modifique el tamaño del pincel como desee y, a continuación, utilice el puntero del ratón para trazar el borde de la entidad de interés. Rellene el área trazada con el atajo F.Agregue la selección haciendo clic en el botón con el símbolo más.

Siga la característica de interés a través de todos los sectores y repita la segmentación de seguimiento manual. Genere una representación de la superficie para la visualización y el análisis cualitativo o cuantitativo básico según las instrucciones de la guía del usuario del software en la pestaña del grupo de objetos, alterne las etiquetas del nombre del archivo am en la ventana del grupo. A continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione surface gen.

Seleccione las propiedades de superficie deseadas y haga clic en aplicar. Se creará un nuevo nombre de archivo surf en el grupo. Para visualizar el volumen segmentado, active la opción de nombre de archivo en la ventana del grupo.

A continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione Vista de superficie. Genere una superficie para la visualización y el análisis cualitativo como se describe en el protocolo de texto. La segmentación automatizada basada en la densidad se utiliza en conjuntos de datos con cualquier variedad de contraste, nitidez o aglomeración para retirar las densidades de interés para comenzar a importar datos de volumen a un programa equipado con una varita mágica de umbrales u otras herramientas basadas en la densidad para la segmentación automática.

Al igual que se hace en la técnica de trazado manual de características de interés, el software Amira se utiliza en esta demostración para características sin márgenes claramente distinguibles. Utilice la herramienta de umbral seleccionando el icono de umbral. Ajuste un control deslizante para ajustar la densidad dentro del rango deseado, de modo que solo se enmascaren las entidades de interés.

Haga clic en el botón de selección y, a continuación, añada una selección haciendo clic en el botón con el símbolo más o con el acceso directo. A generar una superficie para la visualización y el análisis cualitativo como se describe en el protocolo de texto. Todo un cuarto enfoque.

La segmentación automatizada personalizada se puede utilizar para segmentar de manera eficiente grandes conjuntos de datos, pero requiere conocimientos en programas como matlab. Consulte el vídeo complementario sobre la segmentación personalizada para obtener instrucciones paso a paso sobre este método: Se segmentaron seis conjuntos de datos de ejemplo mediante cuatro enfoques. La generación manual de modelos abstractos, el trazado manual de características de interés, la segmentación automatizada basada en la densidad y la segmentación automatizada personalizada La generación manual de modelos abstractos fue efectiva para la resina.

Tomografía teñida incrustada de estereocilios con el propósito de crear un modelo con fines cuantitativos en lugar de extraer densidades exactas para la tomografía teñida incrustada en resina de la pared celular de una planta. La segmentación automatizada basada en la densidad fue más efectiva para extraer rápidamente la celulosa a través de muchas rebanadas. Los métodos manuales requerían más esfuerzo en solo unos pocos segmentos de datos.

La generación manual de modelos abstractos produjo el triplete de microtúbulos en la tomografía de estadios de kinocilio, mientras que los dos enfoques automatizados extrajeron las densidades más rápidamente y, por lo tanto, se prefirieron debido a la forma de las mitocondrias a partir de haces de iones enfocados, microscopía electrónica de barrido de células epiteliales de mama. El rastreo manual proporcionó el resultado más limpio y la baja densidad de población permitió una segmentación rápida. Dado el gran volumen que debía segmentarse, la segmentación automatizada personalizada demostró ser la más eficiente para segmentar los datos de bacterias de microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie.

Aunque requirió mucho tiempo, el único método para extraer la microscopía electrónica de barrido por haz de iones enfocado de la membrana de las células epiteliales de la mama fue el trazado manual. El desarrollo de los enfoques de segmentación allana el camino para que los investigadores en este campo emergente de la biología celular estructural exploren y determinen la arquitectura celular 3D a nivel de complejos macromoleculares, orgánulos y células en una gran variedad de cultivos celulares, cultivos de organoides u organismos modelo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo elegir y aplicar el enfoque de segmentación óptimo para su conjunto de datos.