Los ensayos bioquímicos para Actividades Analizando de ATP-dependientes remodelación de la cromatina enzimas

El objetivo del siguiente procedimiento es medir las diversas actividades bioquímicas de un complejo de remodelación de cromatina dependiente de TP. Esto se logra midiendo un deslizamiento dependiente de TP de un nucleosoma de posición desde un extremo de una molécula de ADN a una posición más central en el ADN mediante el uso de un ensayo de cambio de movilidad electroforética o emsa. Se puede utilizar un método similar basado en EMSA para monitorear la formación de zonas mononucleológicas unidas a complejos de remodelación para evaluar la actividad de unión a nucleosomas de los complejos de remodelación de la cromatina.

Además, la cromatografía en capa fina se puede utilizar para medir la actividad de los APAs de un complejo de remodelación de la cromatina dependiente de TP. En última instancia, estos métodos se pueden utilizar para medir la remodelación de la cromatina humana dependiente de TP en complejos de O 80. En este video, demostraremos ensayos bioquímicos que estudian los complejos de remodelación de la cromatina NO 80.

También se puede aplicar un método similar para estudiar otros complejos de remodelación de la cromatina para realizar el ensayo de remodelación de nucleosomas dependiente de TP. Primero prepare los sustratos de nucleosomas después de configurar una reacción de PCR de 100 microlitros como se describe en la tabla. Realice las reacciones de PCR en un termociclador y luego pase los productos de la reacción dos veces a través de columnas de centrifugado libre de nucleasas para eliminar cualquier nucleótido no incorporado.

A continuación, mezcle dos fragmentos de ADN marcados con P 32 6 0 1 con seis microgramos de nucleosomas hiliares en 50 microlitros de tampón, e incube la mezcla a 30 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, diluir secuencialmente la mezcla a cloruro de sodio a 0,8 molar, 0,6 molar y 0,4 molar mediante la adición de 12,5 microlitros, 20,8 microlitros y 41,6 microlitros respectivamente de solución tampón tris HCL suplementada con E-D-T-A-P-M-S-F y DTT incubar durante 30 minutos a 30 grados centígrados después de cada adición, después de la última incubación a 125 y luego 250 microlitros del tampón de clorhidrato tris. Además, se complementó con glicerol P 40 sin endeudamiento y PSA en dos diluciones más, de 30 minutos y 30 grados Celsius a cloruro de sodio de 0,2 molar y 0,1 molar respectivamente.

A continuación, almacene el sustrato de mononucleosoma a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres meses antes de configurar los ensayos en geles de poliacrilamida nativa. Luego, para cada reacción que se vaya a realizar, combine alrededor de 20 nanomolares en oh 80 con la cantidad adecuada de tampón EB 100 suficiente para dar un volumen de 4,75 microlitros en un siliconado preenfriado. El tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros vuelve a congelar inmediatamente cualquier fracción restante que contenga NO 80, hielo seco en polvo imp.

A continuación, dispense 5,25 microlitros de cóctel maestro recién preparado a cada tubo de reacción, mezclando bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, incubar las reacciones en un bloque de calor a 30 grados centígrados. Al final de la incubación, agregue 1,5 microlitros de mezcla de eliminación recién preparada a cada tubo para terminar las reacciones, luego mezcle cada tubo de reacción.

Bueno, gírelos hacia abajo e incubelos a 30 grados centígrados durante otros 30 minutos. Mientras tanto, preejecute el gel de poliacrilamida nativo en una unidad de electroforesis vertical a 100 voltios durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, utilizando 0,5 XTBE como tampón de funcionamiento con una barra de agitación magnética dentro de la cámara inferior para mantener una circulación constante del tampón al final de la incubación con la mezcla de eliminación, mezcle 2,5 microlitros de matriz de carga con cada reacción. Y después de un breve giro, use los consejos de carga para cargar las muestras en el gel.

Haga funcionar el gel a 200 voltios durante 4,5 horas a cuatro grados centígrados con circulación tampón. Luego, transfiera el gel a una pila de dos hojas de papel de filtro y deje caer los filtros de papel con el gel encima usando una envoltura de plástico transparente para detectar la señal. Exponga el gel a una pantalla de almacenamiento de fósforo a cuatro grados centígrados durante el tiempo deseado y, a continuación, escanee la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos y analice los datos utilizando el software adecuado para realizar los ensayos de APA dependientes de ADN y nucleosomas.

Comience combinando de 10 a 50 nanomolares de los subcomplejos inmunopurificados con una cantidad de tampón eeb 100 suficiente para dar un volumen de 2,2 microlitros en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros lubricado previamente para cada reacción, y luego vuelva a congelar inmediatamente cualquier fracción que contenga NO 80 en hielo seco en polvo. A continuación, mezcle suavemente 2,8 microlitros de subcóctel recién preparado que contenga nucleosomas de ADN o ninguno de ellos con los tubos de reacción que contengan enzimas con pipeteo ascendente y descendente y transfiera los tubos a un bloque de calor de 30 grados centígrados. A continuación, utiliza un lápiz para dibujar una línea muy ligera a al menos 1,5 centímetros del borde inferior de un polietileno de 20 por 10.

Me refiero a la cromatografía en capa fina o placa TLC. A continuación, coloque 0,5 microlitros de cada mezcla de reacción en la línea a los 5, 15, 30 y 60 minutos después de la incubación, devolviendo inmediatamente cada muestra al bloque de calor, de modo que se puedan tomar varios puntos de tiempo de un solo tubo. Después de aplicar la última muestra, use un secador de pelo para secar la placa y luego transfiera la placa a una cámara de vidrio que contenga suficiente.

Fosfato de potasio de 0,375 molar para permitir que los 0,5 centímetros inferiores de la placa TLC se sumerjan en la solución. Cubra la cámara y desarrolle la reacción hasta que la parte delantera de la fase líquida llegue a la parte superior de la placa TLC, momento en el que la placa debe secarse inmediatamente con secador y exponerse a una pantalla de almacenamiento de fósforo a temperatura ambiente. Finalmente, escanee la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos para determinar la cantidad de radiactivo un sustrato TP y un producto DP.

Este primer experimento demuestra que el complejo se purifica a través de la bandera IES, dos banderas, N-O-A-T-E y la bandera NO 80 delta N tienen actividades de deslizamiento de nucleosomas similares, lo que indica que el extremo NO 80 N y/o sus subunidades asociadas son prescindibles para la remodelación de nucleosomas por el complejo NO 80. Por el contrario, el complejo se purifica a través de la bandera NO 80 delta n delta HSA están inactivos en este ensayo, lo que indica que la actividad de remodelación depende del dominio HSA de los APA NO 80 y/o sus subunidades asociadas. Utilizando una modificación del procedimiento de ensayo deslizante NUCLEOSOMA, se puede medir la actividad de unión a nucleosomas de los complejos de remodelación de la cromatina.

En este experimento, la incubación de los nucleosomas con cantidades crecientes de complejos NO 80 intactos purificados a través de la subunidad NO 80 E condujo a una desaparición dependiente de la dosis de la banda correspondiente a las zonas de mononucleos libres y la aparición de una nueva especie desplazada que migró cerca de la parte superior del gel. En contraste, mientras que los nucleosomas se incubaron con complejos más pequeños que se purificaron a través de NO 80 delta N y que carecían de un subconjunto de subunidades NO 80, las especies desplazadas migraron más rápidamente, lo que sugiere que la movilidad relativa de la banda súper desplazada está determinada por el tamaño del ensayo de complejos. En este experimento final, se muestran los resultados de un ensayo que compara las actividades de APAs activados por ADN y NUCLEOSOMA de dos subcomplejos NO 80 diferentes.

Las manchas de migración más lenta corresponden al alfa 32 P inicial etiquetado como TP, y las especies que migran más rápidamente son los productos de reacción A DP con las áreas que indican la dirección de la migración del solvente. Al usar estos procedimientos, es importante recordar realizar ensayos que varíen en el tiempo y que contengan diferentes concentraciones de enzimas. Esto asegurará que se tomen medidas cuando las curvas de tiempo y dosis-respuesta del producto sean lineales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar las actividades de unión a nucleosomas y deslizamiento de nucleosomas de los complejos de remodelación de cromatina purificados. No olvide que trabajar con materiales radiactivos puede ser peligroso. Se deben tomar precauciones como el uso de una bata de laboratorio y protección ocular, el control de la contaminación radiactiva y la eliminación adecuada de los desechos radiactivos.