El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino
8 de agosto de 2014
Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T.
El objetivo general de este procedimiento es aislar, identificar y purificar las células epiteliales tímicas o la tecnología. Esto se logra primero enzimáticamente, digiriendo y alterando mecánicamente el timo para disociar la tecnología en una suspensión de una sola célula. A continuación, la tecnología puede analizarse mediante citometría de flujo o enriquecerse mediante una estrategia de paneo.
En última instancia, los subconjuntos epiteliales tímicos se pueden purificar mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia. Este método puede ayudar a responder muchas preguntas clave en el campo del desarrollo de células T, como por ejemplo, ¿cómo promueven las células epiteliales tímicas la selección tímica? ¿Qué causa la disfunción tímica en animales envejecidos y cómo podemos lograr la reconstitución de las células T in vitro?
Las principales ventajas de esta técnica son la alta recuperación de células germinales emmicas variables, el enriquecimiento imparcial de las células epiteliales emmicas y la alta pureza que se puede lograr en última instancia mediante la clasificación de células. Para aislar las células del estroma tímico, primero identifique el timo, que se encuentra justo debajo de las costillas y se ve como dos lóbulos blancos delgados que recubren el corazón. Luego, desconecte el tejido conectivo que rodea el timo y use pinzas dentadas curvas para tirar y quitar suavemente los lóbulos tímicos.
Coloque los lóbulos en una placa de seis pocillos que contenga cinco mililitros de medio y recorte la grasa y el tejido conectivo circundantes. A continuación, transfiera los lóbulos recortados a un nuevo pocillo que contenga cinco mililitros de solución enzimática recién preparada y utilice unas tijeras finas para hacer pequeñas incisiones en el tejido. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados.
Después de 20 minutos, pipetee suavemente el tejido hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta de cinco mililitros para disociar la suspensión en una sola celda. Recoja la fracción sobrenadante en un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de tampón rico en albúmina fría en hielo para neutralizar las enzimas. A continuación, añada 2,5 mililitros de solución enzimática al tejido restante.
Incuba la placa durante 15 minutos. Después de eso, agite suavemente el tejido con una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de 18 genes para romper los agregados. A continuación, transfiera el al tubo de recolección.
A continuación, añada 2,5 mililitros de solución enzimática al tejido restante. Incuba la placa durante 15 minutos. Después de la tercera incubación, repita la agitación mecánica con una aguja 20 5G.
Después de incubar el tejido durante los últimos cinco a 10 minutos, transfiera el sobrenadante al tubo de recolección para la centrifugación y el fin de identificar la tecnología recuperada mediante citometría de flujo. Siguiendo los procedimientos estándar de tinción de anticuerpos, ejecute las muestras en un citómetro de flujo multiparamétrico y analice los datos utilizando el software de análisis de fax adecuado para enriquecer aún más la tecnología mediante el método de paneo. En primer lugar, incubar las células con el anticuerpo adecuado para el enriquecimiento. A continuación, agregue la suspensión de celdas a una placa de paneo precodificada y luego agite la placa e incube a temperatura ambiente.
Después de 30 minutos, agite la placa vigorosamente y luego transfiera el sobrenadante a un tubo cónico. Enjuague la placa dos veces con agua fresca, media, acumulando los lavados en el tubo de recolección. Luego, después de girar las células, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio fresco y transfiera la suspensión celular a una nueva placa de paneo, recogiendo las células después de girar e incubar como se acaba de demostrar para purificar aún más la tecnología enriquecida en sus subconjuntos de células tímicas.
Después de marcar con los anticuerpos apropiados, clasifique la tecnología a través de una boquilla de 100 micrómetros mediante clasificación celular activada por fluorescencia, recolectando las células en un 30% de volumen por volumen FBS en medio. En esta estrategia representativa de compuerta para la identificación de la tecnología por citometría de flujo, se puede observar la expresión de epca, pero no de CD 45 por parte de la técnica. Por lo tanto, la tecnología se puede controlar de acuerdo con su expresión ep, camm y CD 45 la tecnología se compone de subconjuntos epiteliales corticales o CEC y medulares o mtech thymic.
Estos subconjuntos se pueden distinguir por el anticuerpo vivo 51, que reconoce la G glutamil aminopeptidasa expresada por ctec y la lectina UEA uno, que se une a mtech tanto ctech como Mtech expresan MHC Clase dos en sus superficies. Aunque mtech se puede clasificar en poblaciones mtech baja y mtech alta, dependiendo de su nivel de expresión de MHC dos, se puede recuperar aproximadamente ocho veces más tech utilizando el protocolo basado en la enzima liasa recién demostrado en comparación con un protocolo con colagenasa y espacio de disco con aproximadamente nueve veces 10 a la quinta, capaz de recuperarse de un solo timo de ratón para disminuir el tiempo de clasificación y aumentar la viabilidad de la células estromales recuperadas. El paneo se puede utilizar, como se acaba de demostrar, para agotar los sitios de los timocitos en comparación con las células de timo preparadas completas.
La proporción de tecnología aumenta de menos del 0,5% a más del 15% en la población de células postenriquecidas. Después del panoramizado, las proporciones de los subconjuntos tecnológicos no se alteran, lo que sugiere que ninguno de los subconjuntos se pierde selectivamente durante el panoramizado. En comparación con la muestra de enriquecimiento de acicalamiento, la tasa de recuperación de la tecnología es de aproximadamente el 85%Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo enriquecer las células germinales temáticas de más de por pánico, así como cómo identificar y purificar más subyentes epiteliales temicos mediante citometría de flujo.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para el aislamiento, identificación y purificación de células epiteliales tímicas de ratón (TECs). El protocolo está diseñado para facilitar estudios sobre la función del timo, el desarrollo de linfocitos T y la disfunción tímica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología Celular
- Función del Timo
Antecedentes
- Las células epiteliales tímicas desempeñan un papel crucial en el desarrollo de los linfocitos T.
- El estudio de las CTE puede proporcionar información sobre los procesos de selección tímica.
- La disfunción tímica está asociada con el envejecimiento y diversas enfermedades.
- La reconstitución de los linfocitos T es fundamental para las estrategias terapéuticas.
Objetivo del estudio
- Aislar y purificar las CTE para su análisis detallado.
- Investigar los mecanismos de la selección tímica.
- Explorar las causas de la disfunción tímica en el envejecimiento.
Métodos Utilizados
- Digestión enzimática y ruptura mecánica del timo.
- Citometría de flujo para el análisis de las CTE.
- Estrategia de enriquecimiento por panning de las CTE.
- Ordenación de células por activación de fluorescencia para la purificación de subpoblaciones de CTE.
Resultados Principales
- Aislamiento y purificación exitosos de las CTE.
- Identificación de subpoblaciones clave de CTE implicadas en el desarrollo de linfocitos T.
- Conocimientos sobre los mecanismos de selección tímica.
- Implicaciones potenciales para las terapias de reconstitución de linfocitos T.
Conclusiones
- El método descrito es eficaz para estudiar las CTE.
- Los hallazgos contribuyen a comprender la función y disfunción tímica.
- La investigación futura puede basarse en este protocolo para explorar el desarrollo de linfocitos T.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar poblaciones estromales raras, como las células epiteliales tímicas, permite reducir mecanismamente los riesgos asociados a las hipótesis sobre el desarrollo de linfocitos T y respalda la confianza predictiva en la validación de dianas para inmunoterapia. Este método proporciona un sistema relevante para estudiar la selección y disfunción tímica en enfermedades, aportando información directa para el diseño de modelos preclínicos y el descubrimiento de biomarcadores traslacionales. Al mejorar la recuperación y viabilidad de subpoblaciones celulares raras, reduce la ambigüedad biológica en las fases iniciales del descubrimiento y mejora las decisiones de selección de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función de las células epiteliales tímicas en las vías de compromiso y selección de linfocitos T.
- Valor operativo: Proporciona un enriquecimiento imparcial de TEC raras a partir del timo de ratón, aumentando el rendimiento aproximadamente ocho veces en comparación con los métodos basados en colagenasa.
- Valor científico: Facilita la desvinculación biológica al permitir la identificación mediante citometría de flujo multiparamétrica de subpoblaciones de TEC corticales y medulares.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera subpoblaciones purificadas de CTE adecuadas para ensayos funcionales posteriores, como el perfilado de expresión génica y la transferencia Western.
- Valor operativo: Reduce el tiempo de clasificación celular y minimiza la pérdida de viabilidad mediante el agotamiento de timocitos por placa previo a la FACS.
- Valor operativo: Permite la preparación estandarizada de suspensiones de células individuales a partir del estroma tímico para ensayos inmunológicos reproducibles.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades relacionadas con la disfunción tímica en estudios de envejecimiento y reconstrucción inmunitaria.
- Valor operativo: Facilita la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al proporcionar CTE purificadas para la reconstrucción in vitro de linfocitos T.
- Valor científico: Permite la desviación mecanicista de dianas implicadas en la selección tímica y las vías de desarrollo de linfocitos T.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad de biología de descubrimiento hasta la identificación de candidatos al proporcionar insumos estromales validados para la evaluación de dianas inmunológicas y estudios mecanicistas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre los roles del epitelio tímico en la selección positiva y negativa de linfocitos T mediante subpoblaciones aislables y analizables.
- Selección: Proporciona poblaciones de CTE purificadas y listas para ensayos, con mayor recuperación y menor tiempo de clasificación, para la selección de compuestos o moduladores.
- Análisis: Permite citometría de flujo multiparamétrica cuantitativa y perfiles moleculares (PCR, inmunotransferencia) para la comparación objetiva de estados de los CTE.
- Investigación Traducional: Se conecta con modelos preclínicos de reconstitución de linfocitos T al proporcionar CTE purificados capaces de sostener el desarrollo linfoide in vitro.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo escalable y estandarizado para el aislamiento de células estromales tímicas raras, aplicable en diversos programas de descubrimiento en inmunología e inmunoterapia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los modelos de desarrollo de linfocitos T al permitir el aislamiento y caracterización confiable de subpoblaciones raras de células epiteliales tímicas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante disociación enzimática-mecánica y enriquecimiento por panning antes de la citometría de flujo (FACS).
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en fases tardías al mejorar la validación de dianas en vías inmunológicas dependientes del timo.
- Impacto en el portafolio: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar conocimientos mecanicistas sobre la selección tímica y la interacción cruzada estroma-inmune.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disociación enzimática de tejidos, tinción para citometría de flujo y clasificación de células por fluorescencia.
- Depende del acceso a incubadores de cultivo celular, centrífugas, citómetros de flujo y placas de adhesión recubiertas con sustratos adecuados.
- Necesita la estandarización de los tiempos de digestión enzimática y de los pasos de agitación mecánica para garantizar una calidad consistente de la suspensión celular individual.
- Requiere consideraciones de adaptación al aplicarse a diferentes cepas de ratón, edades o modelos de enfermedad que afecten la celularidad tímica y la composición estromal.
- Las limitaciones prácticas incluyen la rareza de las células epiteliales tímicas, lo que exige pasos de enriquecimiento, y la necesidad de mantener cuidadosamente la viabilidad durante clasificaciones prolongadas.
