Desarrollo de una In vitro Sistema modelo para estudiar la interacción de Equus Caballus IgE con su receptor de alta afinidad Fc RI

El objetivo general del siguiente experimento es medir la cantidad de liberación de mediadores dependientes de IgE de las células de leucemia basófila RAD. Los síntomas de la alergia son causados por la liberación de mediadores como la histamina. Ahora bien, la histamina no es el único mediador que liberan los basófilos, son los mastocitos.

El total de todos los mediadores que liberan estas células da lugar a los signos y síntomas de hipersensibilidad inmediata y tardía. Ahora bien, los humanos no son los únicos organismos que sufren de alergia que sufren los perros y los caballos. Con el fin de desarrollar aún más la investigación y encontrar tratamientos contra la alergia, como las vacunas, se requiere un ensayo de liberación para cuantificar la cantidad de mediadores liberados, si los hay, del tratamiento de investigación.

Esta es la razón de este ensayo de liberación. El ensayo liberado por el mediador RBL para el sistema humano fue desarrollado y publicado por primera vez por Ian y Hook en 1986. Más tarde se desarrolló para el sistema DOC y ahora para el sistema de caballos.

Las modificaciones son tan sencillas como cambiar las proteínas de interés. La noticia de la línea celular fue la leucemia Rat Baso o RBL dos H 3.1 línea celular que expresa la cadena alfa de los receptores equino FNT ffc Serin R one a una densidad celular de 500.000 células por mililitro. Añadir el anticuerpo IgE de interés hasta una concentración final de un nanogramo por mililitro.

Agregue 100 microlitros de la mezcla en una placa de tierra de 96 e incube durante 16 horas a 37 grados. Esto permite que las células se adhieran a la superficie del pocillo y el anticuerpo se une a su receptor de lavado. El doble de los medios que contienen el anticuerpo no unido restante y las células muertas con 100 microlitros de tampón caliente de 37 grados liberan.

Deseche el tampón del último lavado y reemplácelo con 100 microlitros del antígeno de interés a la concentración de interés. Después de una incubación de 20 minutos a 37 grados, transfiera 50 microlitros de la natina SUP que contiene los mediadores de liberación a un nuevo pocillo y reemplace el sobrenadante restante con tampón Triton X de 50 microlitros para eliminar las células y liberar los mediadores restantes dentro de las células. A 50 microlitros de 2 millones de beta molares hx.

Muchos días sustrato disuelto en tampón de citrato. Después de una incubación de dos horas a 37 grados, agregue 150 microlitros de tampón tris a cada pocillo haciendo que el pocillo se vuelva amarillo. Mida la absorbancia de color a 405 nanómetros después de 16 horas.

Caliente el tampón de ensayo de liberación, también conocido como tampón Ian, a 37 grados. Prepare también el gradiente de concentración del antígeno en el tampón de liberación a concentraciones. Cero 0,1 1, 10, 100, 1000 y 10.000 nanogramos por mililitro.

Luego caliente a 37 grados. Lave los pocillos agitando rápidamente el plato para eliminar el medio y agregue suavemente 100 microlitros de tampón de liberación tibia hacia las paredes de los pocillos. Esto es para reducir el estrés celular por la diferencia de temperatura, lo que hace que liberen mediadores prematuramente.

El plato debe lavarse dos veces. Deseche el tampón de liberación final, lave y agregue 100 microlitros de antígeno, comenzando con cero concentración de antígeno en la fila A para el control negativo, y bajando por el gradiente de concentración de las filas B a G y finalmente a las rodajas Triton X, tampón en la fila H. Eso es para el control positivo. Incubar la placa durante 20 minutos a 37 grados.

Este es el punto en el que las células liberan mediadores después del período de incubación. Transfiera 50 microlitros del líquido de cada pocillo a su respectivo pozo. En la columna siete a la 12, saque completamente y deseche el líquido restante en las posiciones uno a seis y reemplácelo con 50 microlitros de tampón de lisis Triton X.

Añade 50 microlitros del sustrato preparado a los 96 pocillos del plato. Incubar a 37 grados durante dos horas. El beta H, muchos días conversa el sustrato en cuatro nitrofenoles.

Después del período de incubación, detenga la reacción agregando 150 microlitros de tampón tris, convirtiendo los cuatro nitrofenoles en un color amarillo. Lea la placa usando un espectrofotómetro de placa a 405 nanómetros. Después de medir los datos de absorbancia, calcule la cantidad total de mediadores dentro de las celdas en la posición A de los pocillos multiplicando uno.

Corresponde bien en la posición a siete por dos y suma el resultado al valor en un uno. Esto se debe a que durante el experimento, tenemos el supinato que contiene la oposición de los mediadores de liberación A uno a medida que lo transferimos a una nueva oposición de pozo. Un siete.

Repita los cálculos para el resto de los pozos. Calcule el porcentaje de mediadores de liberación en la oposición del pozo, A siete del total calculado de mediadores dentro de las celdas multiplicando el valor de la posición A siete por dos. De nuevo, porque durante el experimento, tenemos el supernat que contiene a los mediadores de Reese.

A medida que lo transferimos a un nuevo, entonces multiplique ese producto por 100 y divida ese producto por el valor total correspondiente de los mediadores dentro de las celdas para esa posición. Esto da el porcentaje de mediadores de liberación para el oleaje. Repita los cálculos para el resto de los pozos, ya que los seis oleajes de cada fila se ven desafiados por la misma concentración de antígeno promedio.

Estos valores y calcular la desviación estándar trazan estos valores en un gráfico de la siguiente manera. El gráfico muestra que a medida que aumenta la concentración de antígeno, se liberan más mediadores hasta que alcanza un máximo de 100 nanogramos por mililitro, después de lo cual la liberación de mediadores disminuye con el aumento de la concentración de antígeno. El resultado experimental final debería ser similar a estos gráficos, como se puede ver en el gráfico B. El ensayo de liberación de control en azul claro no contiene anticuerpos IgE y, por lo tanto, no muestra cambios en la liberación de mediadores con el aumento de la concentración de antígenos.

Compare esto con el resultado experimental en azul oscuro, que podría contener anticuerpos IgE. Este es un ejemplo de una vacuna anti-IgE que se está probando para determinar su seguridad. De este gráfico en rojo se desprende claramente que el suero anti-IgE se entrecruza con los receptores de la superficie celular, lo que hace que las células RBL se desgranulen, tal como se observa en el control positivo en púrpura en comparación con el control negativo en gris, lo que hace que esta vacuna no sea segura.

Este ensayo es muy útil, ya que puede medir la liberación del mediador, o el retraso del mismo cuando se prueban posibles medicamentos antialérgicos o vacunas, también se puede adaptar para los sistemas canino o equino humano, como se muestra, el ensayo puede determinar el bloqueo exitoso o incorrecto de la liberación del mediador cuando se prueban anticuerpos antialérgicos.