Adaptación videofluoroscópicos Swallow Métodos de Estudio Humanos para detectar y caracterizar disfagia en modelos murinos de enfermedades
1 de marzo de 2015
Este estudio adaptado con éxito videofluoroscópico tragar estudio (VFSS) métodos humanos para su uso con modelos de enfermedad murinos con el fin de facilitar la investigación traslacional disfagia.
El objetivo general de este procedimiento es estudiar la función de la deglución en roedores que se comportan libremente, lo que se conoce primero como estudio de deglución videofluoroscópico o VFSS. Se construye una cámara de alimentación para confinar a los roedores en un espacio pequeño durante las pruebas. El segundo paso es realizar el acondicionamiento conductual con una solución de prueba para garantizar la máxima participación.
El siguiente paso es realizar pruebas VFSS con los ratones preacondicionados. Por último, los vídeos se someten a un análisis fotograma a fotograma para cuantificar los parámetros de deglución. En última instancia, esta novedosa herramienta de evaluación se puede utilizar para detectar y caracterizar la disfagia en modelos de enfermedad espejo y proporcionar biomarcadores funcionales para su uso en ensayos preclínicos.
Primero tuvimos la idea de usar cámaras de observación porque las pruebas de VFSS en humanos son voluntarias y sin restricciones, y queríamos imitar de cerca el procedimiento clínico humano. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos similares existentes es que provoca rápidamente comportamientos de alimentación voluntarios en roedores para permitir pruebas rápidas de todas las etapas de la deglución. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con el análisis de video porque los movimientos pequeños y rápidos de la deglución y los ratones son difíciles de discernir.
Comience ensamblando las cámaras de observación a continuación, ensamble un sistema de administración de jeringas para administrar la solución a los tazones de clavijas durante la prueba. Una vez montada, coloque la cámara de observación en un elevador de tijera motorizado para su posicionamiento remoto. La principal ventaja de la mesa elevadora de tijera con control remoto es la mejora de la seguridad radiológica para los investigadores, al tiempo que mantiene a los roedores que se comportan libremente en el campo de visión de la fluoroscopia.
Prepare a los ratones habituándolos a la cámara de observación y sometiéndolos a un período de regulación del agua durante la noche. Cuando esté listo para la prueba, retire la cámara de la jaula y límpiela a fondo. Use un marcador de borrado en seco para etiquetar cada tubo limpio antes de volver a colocarlo en la jaula de casa.
A continuación, prepare la solución de iohexol con sabor a chocolate para configurar el entorno de fluoroscopia. Utilice una cámara de observación de repuesto y un recipiente de clavijas para determinar la altura y la posición óptimas dentro del haz del fluoroscopio que permiten la visualización de la bebida en el plano lateral. Establezca la velocidad de fotogramas de la fluoroscopia en 30 fotogramas por segundo.
Se pueden utilizar velocidades de fotogramas más altas si están disponibles. Asegúrese de que un marcador de calibración radiopaco esté colocado adecuadamente en la cámara del fluoroscopio para que sea visible en la pantalla durante toda la prueba. Este paso es necesario para permitir la calibración de las mediciones de longitud para reducir el estrés debido a la manipulación.
Observa la jaula hasta que un ratón entre libremente en la cámara de observación. Una vez dentro, levante la cámara fuera de la jaula y coloque suavemente la segunda tapa del extremo. Con pruebas repetidas, se puede persuadir fácilmente a los ratones para que ingresen a la cámara cuando se coloca frente a ellos dentro de la jaula, o cuando están suspendidos por la cola sobre la abertura de la cámara.
Coloque la cámara de observación dentro de la máquina de fluoroscopia para comenzar la prueba VFSS en el plano lateral. A continuación, use un sistema de administración de jeringas para llenar el recipiente de clavijas con una solución de iohexol con sabor a chocolate. Inicie la grabación de la videofluoroscopia.
Cuando el ratón empiece a beber durante la prueba, utilice la mesa elevadora con mando a distancia para ajustar la posición de la cámara de observación de modo que el mecanismo de deglución sea visible en el campo de visión. Pausa la grabación cada vez que el ratón se aleje del recipiente para minimizar la duración de la exposición a la radiación. Reanude la grabación cuando el mouse regrese al tazón de clavijas, vuelva a llenar el tazón de clavijas según sea necesario.
El objetivo es registrar varios episodios largos de bebida continua, que es típico de la mayoría de los ratones. Dentro de los primeros dos minutos de la prueba, detenga la prueba si el ratón no bebe dentro de los cinco minutos, devuelva los ratones que no cumplan con la prueba a la jaula doméstica para volver a realizar la prueba en un momento posterior el mismo día. No exceda una regulación de agua de 24 horas.
Al probar varios ratones de la misma jaula doméstica. Limpie el recipiente de clavijas y el tubo con una toalla de papel seca entre ratones. Recorte la punta del tubo de PE según sea necesario.
Si se mastica durante la prueba, limpie la cámara de observación según sea necesario para eliminar cualquier salpicadura de iohexol en las paredes de la cámara. Enjuague la cámara con agua del grifo y séquela con una toalla de papel. Utilice un programa de software de edición de vídeo que permita el análisis fotograma a fotograma de las grabaciones de fluoroscopia de vídeo.
Para cuantificar los parámetros de deglución de interés, al menos dos revisores capacitados deben analizar cada video de manera ciega. El revisor principal ve cada video para identificar y analizar de tres a cinco episodios largos de bebida. Este criterio se basa en estudios de deglución no radiográficos publicados que muestran que este parámetro es suficiente para el análisis estadístico.
A continuación, el revisor secundario analiza de forma independiente las tres a cinco medidas por parámetro de deglución para cada ratón que fueron identificadas y analizadas inicialmente por el revisor principal. A continuación, se identifican las discrepancias de los revisores para cada ratón y se vuelven a analizar hasta que se alcanza el 100% de consenso. A continuación, se promedian los valores indiscutibles de cada parámetro de deglución para obtener el valor medio de cada ratón.
Cuando se obtengan menos de tres medidas para un parámetro de deglución, introduzca un valor que falte en la base de datos estadístico para esa medida. Estos ejemplos se obtuvieron utilizando una posición del sistema de fluoroscopia de baja energía. Uno permite la visualización de toda la cabeza y la región torácica proximal.
El punto gatillo de la deglución está centrado dentro del campo de visión. La posición dos permite la visualización desde el punto gatillo de la deglución hasta la unión gastroesofágica. Obsérvese que el bolo pasa a través del esófago distal incluso en el ajuste de aumento más bajo.
Las estructuras óseas de la cabeza y el cuello son fácilmente visibles utilizando el sistema de fluoroscopia de baja energía. Las estructuras anatómicas también se examinan con mayor aumento para permitir la cuantificación de varios parámetros adicionales de la deglución. Esta figura muestra hallazgos preliminares representativos para dos parámetros de deglución de VFSS, la tasa de deglución y la tasa de deglución entre degluciones fue significativamente más lenta para los ratones SOD 1 en comparación con los C 57 años.
El intervalo entre deglución de ratones y controles no fue significativamente diferente entre los grupos. Una vez dominado, la captura de video se puede completar en poco menos de dos minutos por masa si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar la solución de prueba con sabor a chocolate a las pocas horas de la preparación para evitar cambios en la viscosidad y la palatabilidad que pueden resultar en comportamientos de evitación.
Esta nueva técnica está allanando el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploren los comportamientos naturales de alimentación y deglución en roedores sanos y modelos de enfermedades. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar con éxito las pruebas VFSS de roedores que se comportan libremente. Para cuantificar los comportamientos típicos de alimentación y la función de deglución, no olvide que trabajar con equipos emisores de radiación puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben seguir las precauciones de radiación para el tiempo, la distancia y el blindaje mientras se realiza este procedimiento.
Descripción general
Este estudio adaptó con éxito los métodos humanos de estudio videofluoroscópico de la deglución (VFSS) para su uso con modelos animales murinos, facilitando la investigación traslacional de la disfagia. El procedimiento tiene como objetivo evaluar la función de deglución en roedores con comportamiento libre, imitando de cerca las prácticas clínicas humanas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Análisis del comportamiento
- Investigación traslacional
Antecedentes
- La VFS es un método estándar para evaluar la deglución en humanos.
- Este estudio tiene como objetivo replicar las técnicas de VFS en modelos roedores.
- El método permite la observación de comportamientos voluntarios de alimentación.
- Proporciona una plataforma para detectar disfagia en modelos de enfermedad.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para estudiar la deglución en roedores.
- Crear biomarcadores funcionales para ensayos preclínicos.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de la disfagia en modelos de enfermedad.
Métodos Utilizados
- Construcción de una cámara de alimentación para la contención de roedores durante las pruebas.
- Condicionamiento conductual con una solución de prueba para asegurar la participación.
- Análisis cuadro por cuadro de videos de VFSS para cuantificar los parámetros de deglución.
- Uso de un elevador de tijera controlado a distancia para mejorar la seguridad radiológica.
Resultados principales
- El método logró inducir comportamientos voluntarios de alimentación en roedores.
- Se logró un análisis cuantitativo de los parámetros de deglución mediante análisis de video.
- El consenso entre los revisores aseguró una medición precisa de los parámetros de deglución.
- La técnica demostró potencial para identificar la disfagia en modelos murinos.
Conclusiones
- Esta novedosa adaptación de VFSS es eficaz para estudiar la disfagia en roedores.
- El método proporciona una herramienta valiosa para la investigación preclínica de la disfagia.
- Estudios futuros pueden basarse en este marco para explorar la disfagia en diversos contextos de enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Adaptar los métodos del estudio de deglución videofluoroscópico humano (VFSS) a modelos murinos permite la detección temprana de fenotipos de disfagia en modelos preclínicos de enfermedades, apoyando la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en el desarrollo de fármacos para enfermedades neurodegenerativas y neuromusculares. Este enfoque proporciona biomarcadores funcionales que vinculan los ensayos conductuales con los puntos finales clínicos, mejorando la confianza predictiva en la identificación de compuestos prometedores y en las decisiones de avance preclínico. Al cuantificar la fisiología de la deglución en roedores libremente activos, el método mejora la continuidad traslacional desde la fase de descubrimiento hasta las etapas preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de la fisiología de la deglución como un indicador funcional de la integridad del tronco encefálico y de los circuitos neuromusculares.
- Valor operativo: Permite la condicionamiento conductual y la alimentación voluntaria en espacios confinados, reduciendo la variabilidad inducida por el estrés en la fenotipificación murina.
- Valor científico: Apoya la desestimación biológica de dianas implicadas en el control de la deglución, como SOD1 en modelos de ELA, al vincular la manipulación genética con fenotipos medibles de disfagia.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la estandarización de la cuantificación de parámetros de deglución mediante análisis de video cuadro por cuadro.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante consenso de revisión ciega por dos revisores y criterios definidos para los episodios de bebida.
- Valor científico: Destaca la preparación para cribado y escalabilidad al permitir la prueba rápida de múltiples ratones por sesión mediante posicionamiento de cámara controlado a distancia.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad y la alineación de biomarcadores traslacionales mediante la detección de diferencias específicas del genotipo en la frecuencia de deglución y el intervalo entre degluciones en ratones SOD1 frente a los controles.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al proporcionar parámetros cuantificables de la videofluoroscopia de la deglución que se correlacionan con la progresión de la enfermedad.
- Valor científico: Se centra en el valor predictivo de reducción de riesgos al identificar 13 parámetros de deglución cuantificables de forma consistente mediante fluoroscopia de baja energía, casi duplicando la sensibilidad de detección en comparación con sistemas de alta energía.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde el Descubrimiento Inicial hasta la Identificación de Compuestos Promisorios y el trabajo Preclínico, apoyando la prueba de hipótesis, la aclaración de vías y la reducción de riesgos biológicos de dianas que afectan la función bulbar.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la comprobación de hipótesis, la aclaración de vías o la reducción de riesgos biológicos mediante la cuantificación de la mecánica de la deglución como un indicador de la función de circuitos neuronales en modelos de enfermedad.
- Selección: Describe la preparación del ensayo, su reproducibilidad o sus resultados cuantitativos cuando el artículo lo respalda mediante protocolos estandarizados, análisis ciego y medición de parámetros definidos por consenso.
- Análisis: Destaca las mediciones, lecturas o resultados estadísticos que ayudan a los equipos a comparar condiciones, incluyendo la frecuencia de deglución, el intervalo entre degluciones y el tiempo de tránsito del bolo, derivados del análisis cuadro por cuadro de videos de VFSS.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica o la alineación de biomarcadores solo cuando la fuente lo respalda, demostrando diferencias dependientes del genotipo en la fisiología de la deglución que reflejan los puntos finales clínicos de la disfagia.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable y no como una técnica de uso único, gracias al diseño estandarizado de cámaras, protocolos con agentes de contraste saborizados y un sistema de imagen con operación remota.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de la ambigüedad mecanicista en fenotipos mediados por el tronco encefálico.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad del fenotipado de la deglución en cohortes murinas y laboratorios.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante la identificación temprana de la disfagia en las fases preclínicas.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en datos de biomarcadores funcionales obtenidos mediante la VFSS en modelos de enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados necesarios en pruebas neuroconductuales, operación de fluoroscopía por video y análisis de video cuadro por cuadro.
- Los requisitos de instrumentación e infraestructura analítica incluyen sistemas de fluoroscopía (preferiblemente de baja energía para imágenes murinas de alta resolución), mesas de posicionamiento controladas a distancia y software de edición de video para revisión ciega.
- Los requisitos de estandarización entre equipos implican la armonización del diseño de la cámara, la preparación del agente de contraste (por ejemplo, iohexol con sabor a chocolate) y los criterios de selección de episodios de bebida entre distintos centros.
- Las consideraciones de adaptación entre sistemas modelo incluyen el ajuste del tamaño de la cámara, la palatabilidad del agente de contraste y los protocolos de posicionamiento para diferentes cepas de roedores y grados de severidad de la enfermedad.
- Las limitaciones prácticas respaldadas por la bibliografía incluyen la dependencia del nivel de energía del fluoroscopio para la detectabilidad de parámetros, donde los sistemas de alta energía permiten la cuantificación de siete parámetros frente a trece con sistemas de baja energía.
