Por encargo Microdiálisis Sonda Diseño
21 de julio de 2015
La microdiálisis es una técnica muy utilizada en la investigación en neurociencias. Por lo tanto sondas comerciales están en gran demand.In esta obra un conjunto de sonda se explica en detalle la construcción de una sonda fiable, concéntrico a medida microdiálisis por menos de $ 10.
El objetivo general de este procedimiento es describir el fabricante de una sonda de microdiálisis hecha a medida. Esto se logra cortando primero el tubo de politetrafluoroetileno y la sílice fundida en las dimensiones correctas. El segundo paso es insertar la sílice fundida en el tubo utilizando una cánula como guía.
A continuación, se coloca una membrana de diálisis sobre la sílice fundida. El paso final es tirar del manguito metálico sobre la parte restante de la sílice fundida y utilizar epoxi para cerrar las juntas y asegurar una longitud de intercambio de dos milímetros. En última instancia, las instrucciones de este vídeo mostrarán cómo construir una sonda de microdiálisis robusta y fiable hecha a medida como alternativa a una sonda comercial, que puede medir con precisión la recuperación in vitro de neuropéptidos y moléculas pequeñas.
La principal ventaja de esta técnica es que este conjunto de sonda de microdiálisis presentado en detalle se puede adaptar a cualquier aplicación y se puede fabricar por menos de 10. Para empezar, corta un trozo de tubo de politetrafluoroetileno de 1,6 milímetros de grosor con un diámetro interior de 350 micras en secciones de 2,5 centímetros de largo. Corte un extremo de la sección en un ángulo de 45 grados para facilitar la conexión del tubo de salida.
A continuación, use papel de lija para rugosar la superficie exterior del tubo de PTFE para promover la adhesión de un pegamento epoxi. Corta una sección de sílice fundida en un trozo de 2,25 centímetros de largo. Inserte una aguja de calibre 30 en la fibra de PTFE hueca a un centímetro del extremo plano.
Doble el PTFE y perfore la funda en la curva. Inserte la sílice fundida en el tubo de PTFE utilizando la cánula de aguja como guía. A continuación, retire suavemente la cánula de la aguja y coloque la sílice fundida de modo que cinco milímetros sobresalgan por el extremo plano del tubo de PTFE.
Use una gota de pegamento de cianoacrilato para asegurar la sílice fundida en su lugar en el sitio de la punción y deje que se endurezca durante la noche. Prepare el pegamento epoxi agregando 30 partes de endurecedor amarillo a 70 partes de pegamento epoxi negro y mezcle suavemente. A continuación, extraiga una membrana de diálisis de polisulfona de corte de 30 kilodalton con un diámetro interior de 210 micras y un diámetro exterior de 245 micras.
Con cuidado sobre la sílice fundida. Introduzca la membrana en el tubo de PTFE y ajústela a 5,5 milímetros con un bisturí afilado. Marque un punto en la membrana con un bolígrafo fino para definir la longitud de intercambio de dos milímetros desde el extremo de la membrana.
A continuación, utiliza una aguja fina para aplicar una pequeña cantidad de pegamento epoxi para cubrir la punta de la membrana. A continuación, utilice pegamento epoxi para cerrar la unión entre la membrana de diálisis y la fibra de PTFE. Ahora regrese y agregue suficiente pegamento epoxi en la membrana hasta el punto de marcado.
Para garantizar una longitud de intercambio de difusión de solo dos milímetros, deje que el pegamento epoxi se endurezca durante la noche. Use un par de alicates para romper con cuidado trozos de un centímetro de una aguja de calibre 25 para crear manguitos de metal. Luego, tire del manguito de metal sobre la parte restante de la sílice fundida y use el pegamento epoxi restante para sellar la unión entre el manguito de metal y el tubo de PTFE.
Posteriormente, el manguito metálico permite la conexión del tubo de entrada con una sonda de microdiálisis. Finalmente, aplique pegamento caliente alrededor de la bifurcación de la sonda para una fijación y estabilización adicionales del dispositivo. Este esquema muestra un primer plano del funcionamiento interno de la sonda de microdiálisis.
Dos milímetros de la membrana de diálisis de polisulfona están expuestos en el extremo de la sonda, lo que permite la recuperación de metabolitos de pequeño peso molecular como la glucosa a TP y la acetilcolina. Aquí se muestra la capacidad de la sonda para recuperar moléculas pequeñas de bajo peso molecular como glucosa, lactato, acetilcolina y un TP in vitro. El porcentaje de recuperación es mucho mayor con estas moléculas, que están alrededor de 500 Daltons que las moléculas más grandes como la angiotensina dos, la sustancia p y la somatostatina, que están por encima de los 1000 Daltons.
Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo construir sondas de microdiálisis robustas y fiables como alternativa a las comerciales.
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Descripción general
Este artículo describe el proceso de fabricación de una sonda de microdiálisis personalizada, que es una alternativa rentable frente a las sondas comerciales. El procedimiento describe los pasos necesarios para crear una sonda confiable capaz de medir neuropéptidos y moléculas pequeñas in vitro.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de microdiálisis
- Manufactura de sondas
Antecedentes
- La microdiálisis se utiliza ampliamente en la investigación en neurociencia.
- Existe una alta demanda de sondas de microdiálisis confiables.
- Las sondas fabricadas a medida pueden ser más rentables que las opciones comerciales.
- Comprender la construcción de estas sondas puede mejorar las capacidades de investigación.
Objetivo del estudio
- Proporcionar instrucciones detalladas para construir una sonda de microdiálisis personalizada.
- Ofrecer una alternativa económica frente a las sondas comerciales.
- Asegurar mediciones precisas de neuropéptidos y moléculas pequeñas.
Métodos Utilizados
- Cortar tubos de politetrafluoroetileno y sílice fundida a dimensiones específicas.
- Introducir sílice fundida dentro del tubo utilizando una cánula como guía.
- Colocar una membrana de diálisis sobre la sílice fundida.
- Fijar el conjunto con un manguito metálico y epoxi para garantizar durabilidad.
Resultados principales
- Se puede construir una sonda de microdiálisis personalizada confiable y resistente.
- La sonda es capaz de medir con precisión la recuperación in vitro de neuropéptidos.
- El costo total del ensamblaje de la sonda es inferior a 10 dólares.
Conclusiones
- Las sondas de microdiálisis personalizadas son una alternativa viable a las opciones comerciales.
- Las instrucciones detalladas pueden capacitar a los investigadores para fabricar sus propias sondas.
- Este método puede mejorar la accesibilidad de las técnicas de microdiálisis en la investigación en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La fabricación personalizada de sondas de microdiálisis ofrece una solución rentable para la investigación en neurociencia, permitiendo un monitoreo preciso de la dinámica neuroquímica en el líquido cefalorraquídeo. Al reducir el costo de las sondas por debajo de 10 USD, este método mejora el acceso para instituciones públicas y apoya su implementación escalable en estudios preclínicos. El enfoque facilita la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar datos confiables de recuperación para moléculas pequeñas y neuropéptidos, informando decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la recuperación cuantitativa de glucosa, lactato, acetilcolina, ATP y neuropéptidos en el rango de 100-1.600 Da.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos al proporcionar métricas de recuperación in vitro reproducibles (~20 % para moléculas pequeñas, 2-6 % para neuropéptidos) para aclarar la interacción con el objetivo y la modulación de vías.
- Valor predictivo: Genera conocimientos mecanicistas que mejoran la selección de carteras al diferenciar los efectos de los compuestos según su peso molecular y sus propiedades fisicoquímicas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores al establecer una membrana de diálisis con un límite de exclusión molecular definido (30 kDa) y una longitud de intercambio (2 mm).
- Valor operativo: Fomenta la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante dimensiones de sonda consistentes y un rendimiento uniforme de la membrana entre diferentes clases de sustancias.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma y su adaptación a longitudes de intercambio más grandes para diversos modelos animales, facilitando la preparación para cribado de alto rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta las mediciones neuroquímicas en fase de descubrimiento con la validación preclínica mediante el monitoreo de sustancias relevantes para la patología de la enfermedad.
- Avance Ajustado al Riesgo: Orienta las decisiones preclínicas de avance o interrupción del desarrollo a través de datos cuantitativos de recuperación que reflejan la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y la accesibilidad al objetivo.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita el desarrollo de biomarcadores traslacionales al permitir la detección de neuropéptidos y metabolitos en el líquido extracelular.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, proporcionando lecturas neuroquímicas cuantitativas que respaldan la comprensión mecanicista y la priorización de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la clarificación de vías al medir la recuperación in vitro de neurotransmisores y metabolitos endógenos.
- Selección: Ofrece sistemas listos para ensayos con resultados reproducibles para evaluar los efectos de compuestos sobre el flujo neuroquímico.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (porcentajes de recuperación) que permiten la comparación entre condiciones y el análisis de relaciones estructura-actividad.
- Investigación Traductiva: Conecta el descubrimiento con trabajos preclínicos al generar datos relevantes sobre la interacción con dianas en sistemas relacionados con enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para el monitoreo neuroquímico que puede adaptarse a través de proyectos y sistemas modelo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la medición neuroquímica directa.
- Valor operativo: Garantiza estandarización, reproducibilidad y escalabilidad mediante el ensamblaje de sondas de bajo costo y personalizables.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir la reducción temprana de riesgos biológicos en la fase de descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo mediante datos de recuperación confiables que informan los criterios de avance.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en los principios de microdiálisis, manipulación de membranas y técnicas de unión adhesiva.
- Necesita instrumentación para corte de precisión (bisturí, pinzas), preparación de superficies (papel de lija) y curado (epoxi durante la noche o pegamento caliente).
- Exige estandarización entre equipos en cuanto a dimensiones de la sonda, longitud de intercambio y preparación de la membrana para obtener resultados reproducibles.
- Incluye consideraciones de adaptación para diferentes pesos moleculares de corte, materiales de membrana y longitudes de intercambio en diversos sistemas modelo.
- Comprende limitaciones prácticas como el tiempo de ensamblaje manual, la reproducibilidad dependiente de la habilidad y la necesidad de validación in vitro por cada lote.
