Clonación funcional utilizando una Xenopus Sistema de Expresión de ovocitos

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un ovocito de Xenopus, un sistema de capuchón animal, adecuado para la identificación de productos génicos capaces de inducir una respuesta en un ectodermo competente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como qué genes son necesarios para provocar una respuesta inductiva. La principal ventaja de esta técnica es el uso del ovocito Xenopus, como sistema de expresión, para producir e identificar inductores que actúan sobre un tejido diana, o incluso genes que actúan aguas arriba de los inductores.

La demostración visual de este método es extremadamente útil, ya que los pasos de disección y recombinación dependen en gran medida de la etapa y requieren una técnica refinada. Después de recolectar tejido ovárico de ranas hembras anestesiadas, corte el tejido en pedazos pequeños, cada uno de los cuales contiene aproximadamente de 10 a 20 ovocitos. Y transfiera estos fragmentos, primero a la solución fresca de OR2 y luego a la colagenasa A. Continúe agitando suavemente la mezcla que contiene tejido en un agitador durante una hora.

Luego transfiera los fragmentos a una solución fresca de colagenasa y agite durante una hora más. Espere observar ovocitos defloculados al final de este tratamiento. Se procede a lavar los ovocitos 10 veces en OR2 completo, y luego dos veces en medio de cultivo de ovocitos, abreviado como OCM.

A continuación, coloque los ovocitos en OCM fresco e inspecciónelos visualmente bajo un microscopio de disección. Aísle aquellos en la etapa seis descartando los ovocitos más pequeños e inmaduros. A continuación, coloque los ovocitos en una placa de Petri recubierta de agarosa que contenga OCM y manténgalos a una temperatura de 18 a 20 grados centígrados hasta la inyección.

Para prepararse para la microinyección, coloque el tubo capilar de vidrio en un extractor de agujas, tire de él y luego rompa las puntas del vidrio para generar agujas de aproximadamente 20 micrómetros de diámetro. En un microscopio compuesto, mida las puntas de las agujas con un micrómetro ocular calibrado. A continuación, empuje la arcilla en una capa uniforme en el fondo de una placa de Petri de 35 por 10 milímetros.

Y luego cree ranuras paralelas en esta capa, utilizando una herramienta similar a una sonda de centro comercial. Llene el plato revestido de arcilla con aproximadamente 2 mililitros de 3%Ficoll en 1x solución salina de Barth modificada, o MBS. Y luego transferir los ovocitos a él, utilizando una pipeta de gran diámetro.

Coloque los ovocitos en las ranuras de manera que se mantengan en su lugar durante la microinyección posterior. Usando un microinyector, llene una aguja con aproximadamente dos microlitros de un grupo de ARNm generado previamente y ajuste el equilibrio para producir una ligera presión positiva, lo que evitará que el citoplasma del ovocito sea atraído hacia la aguja durante la inyección. A continuación, inyecta a cada ovocito 20 nanolitros de ARN en la región ecuatorial.

A continuación, deje los ovocitos en el Ficoll MBS durante una hora y, a continuación, transfiéralos suavemente a 1x MBS. Se procede a incubar los ovocitos durante ocho a 24 horas a 20 grados centígrados. Para comenzar el ensayo de la tapa animal, reúna 3/4 veces el medio anfibio normal, abreviado como solución NAM, pinzas finas, un lazo para el cabello, ovocitos previamente inyectados y embriones de xenopus en la etapa 11 a 11.5.

Luego, rompa los deslizamientos de la cubierta de vidrio en fragmentos de aproximadamente un milímetro por dos milímetros de tamaño, y pase estas piezas a través de una llama hasta que sus bordes se pulan y se dibujan. A continuación, presione la arcilla en una sola capa en un plato, como se describió anteriormente. Y use una sonda de centro comercial para crear impresiones individuales en forma de copa con este recubrimiento.

Proceda a llenar el plato con aproximadamente dos mililitros de 3/4x NAM. Y a ella, transferir los ovocitos inyectados, colocando varios de forma que cada uno quede inmovilizado en una sola hendidura. Para preparar los embriones, transfiéralos en un plato que contenga 3/4 veces la solución de NAM.

Seleccione un subconjunto de gástrula para usarlo como controles de estadificación para la edad del ectodermo y transfiéralos a otra placa que contenga la misma solución. Y deja este plato a un lado. En el caso de los embriones que se utilizarán en el tratamiento de la gorra animal, retire sus membranas vitelina con dos pares de pinzas finas.

A continuación, transfiera la gástrula al plato forrado de arcilla con los ovocitos. Para empezar, corte los sombreros de los animales de los embriones con dos pares de foreceps finos, teniendo cuidado de evitar el tejido ecuatorial. Para generar recombinantes utilizando el primer método, coloque las tapas de un animal de modo que la superficie interna entre en contacto con el hemisferio animal de un ovocito, ya colocado en una hendidura.

Y repetir este proceso para varios de los ovocitos inyectados. Para asegurarse de que estos recombinantes se mantengan unidos, coloque un fragmento de cubreobjetos de vidrio curvo encima de cada uno de ellos y aplique presión hacia abajo hasta que el animal se aplane y el cubreobjetos entre en contacto con la arcilla. Para generar recombinantes utilizando el segundo método, coloque los sombreros de los animales y los ovocitos juntos en hendiduras individuales vacías en la arcilla.

Y asegúrese de que las superficies internas de los sombreros del animal estén orientadas hacia el ovocito. Luego, asegure los dos tejidos juntos con pequeñas extensiones de arcilla. Una vez que se han generado múltiples recombinantes utilizando cualquiera de los métodos, el cultivo y la retirada de los embriones de control se realizan a 20 grados centígrados.

Cuando los embriones de control alcancen la etapa deseada, retire los cubreobjetos de los recombinantes y aísle el ectodermo del sombrero animal con pinzas y un lazo para el cabello. Se procedió a la fijación de ambos fragmentos ectodérmicos y embriones control en MEMFA durante una hora. Y transfiéralos a etanol y almacene este tejido a 20 grados centígrados negativos.

Aquí, se inyectaron conjuntos de ovocitos con grupos de ARNm correspondientes a números progresivamente más pequeños de clones o colonias, y luego, se cultivaron con sombreros animales. Posteriormente, se determinó el número de sombreros de animales en cada conjunto que expresan foxe3, un marcador que normalmente se observa en el presunto ectodermo del cristalino desde las primeras etapas de la placa neural hasta la formación de vesículas, y que se utiliza aquí para evaluar la capacidad inductora del cristalino. Este método se identificó en el gen codificante del factor nuclear, ldb1, que puede producir una respuesta inductora de lente en 50 de los 179, o el 28% de las gorras animales evaluadas.

Aquí se muestran nuestras imágenes de hibridación in situ, que muestran la señal de foxe3, indicada por puntas de flecha, en capuchones de animales cultivados con ovocitos inyectados con ldb1 desde aproximadamente la etapa 11 hasta la etapa 23. No se observa expresión de foxe3 en los correspondientes tapones de los animales de control colocados en ovocitos no inyectados. Cuando se generaron secciones a partir de estos sombreros animales, se observó la expresión de foxe3 tanto en la capa ectodérmica interna como en la externa.

La expresión en la capa interna es característica de la respuesta del cristalino. O, como se señala en ambas capas, es indicativo de otras estructuras como la placa olfativa. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos como la inmunohistoquímica, la hibridación in situ o la detección directa de un gen indicador fluorescente, con el fin de evaluar una respuesta inductiva en el ectodermo del sombrero del animal.