Desarrollo de un modelo basado en la rata alfa-sinucleína para la enfermedad de Parkinson mediante inyección estereotáctica de un vector viral adeno-asociado recombinante

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un modelo animal basado en vectores virales para la enfermedad de Parkinson a través de la inyección estereotáctica en el sistema nervioso central. Este método se puede utilizar para desarrollar modelos animales normales que permiten realizar pruebas preclínicas de fármacos y puede ser beneficioso para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad de Parkinson, así como de muchos otros trastornos neurodegenerativos. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para apuntar a regiones específicas del cerebro.

Se puede lograr una alta expresión cerebral y que se puede utilizar para crear modelos animales en cepas y especies animales específicas. Se han desarrollado los diferentes sistemas de vectores finales. La elección del sistema vectorial depende del tamaño de la zanja que se desea expresar, la duración de la expresión génica, los sonidos a los que se desea apuntar y las cuestiones de bioseguridad.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Annelies Aertgeerts, una técnica de nuestro laboratorio. Comience por anestesiar adecuadamente a una rata Wistar hembra de ocho semanas de edad de acuerdo con los protocolos aprobados. Verifique que se haya logrado un plano quirúrgico de anestesia apretando cada pata y notando la ausencia del reflejo de retirada.

A continuación, utilice un implantador de MicroTranspondedor para colocar un MicroTranspondedor en la espalda de la rata. Compruebe que el microtranspondedor esté colocado correctamente y que se pueda obtener una lectura. Ahora corta el pelo en el cuero cabelludo de la rata y aplica anestesia local en el cuero cabelludo y las orejas.

Transfiera la rata a una campana de flujo laminar y realice el resto del procedimiento utilizando técnica aséptica. Coloque a la rata en el marco estereotáxico, asegurando las barras de las orejas, seguidas de la barra de la boca y la nariz. Cubre el cuerpo de la rata con una manta de papel para evitar que baje la temperatura corporal.

Aplícate un lubricante ocular para evitar que los ojos se sequen. A continuación, desinfecte el cuero cabelludo de acuerdo con los procedimientos aprobados. Aquí se utiliza yodo al 70% en isopropilo.

Después de hacer una pequeña incisión en la línea media del cuero cabelludo, raspe suavemente las membranas del cráneo y enjuague con solución salina. Después de dejar que el cráneo se seque, asegúrese de que el bregma y la lambda se puedan ver claramente. Ahora, llene una jeringa de microinyección de 10 microlitros, calibre 30 y 20 milímetros con AAV recombinante y colóquela en la bomba de microinyección motorizada conectada al instrumento estereotáxico.

Para la transacción específica de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, los vectores AV recombinantes son la primera opción debido a sus altos títulos y eficiencia para transducir neuronas dopaminérgicas. Pruebe el flujo, liberando una gota de AAV. Deseche cualquier AAV liberado en un detergente de limpieza polivalente.

Compruebe visualmente que la cabeza esté fijada recta en el marco de la cabeza. A continuación, compruebe que el cráneo está plano, moviendo primero la punta de la aguja al bregma y midiendo la altura en este punto, bajando la punta de la aguja en dirección dorsal-ventral hasta tocar el cráneo. Repita el procedimiento en lambda.

Después de devolver la aguja al brema, mueva la aguja en la dirección anteroposterior y lateral medial a las coordenadas estereotáxicas para la microinyección. Anota las coordenadas. En el lugar de la inyección, mida la altura del cráneo como antes y asegúrese de que no difiera de más de 0,3 mm de la altura del bregma.

A continuación, perfora con cuidado un agujero de dos milímetros en el cráneo. Una vez perforado el agujero, se mide la altura de la duramadre para determinar la referencia a partir de la cual aplicar la coordenada dorsal-ventral. Penetra en la duramadre con una aguja de calibre 26.

Absorba la sangre con el tejido estéril y proceda solo después de que se haya detenido todo el sangrado. Ahora baje lentamente la aguja de la jeringa de microinyección precargada en el cerebro hasta la coordenada dorsal-ventral. Y haz una pausa de un minuto.

A continuación, inyecte tres microlitros de AAV a razón de 0,25 microlitros por minuto. Después de la inyección, deje que la aguja permanezca en su lugar durante otros cinco minutos para evitar el reflujo a lo largo de la pista de la aguja antes de retirarla lentamente. Coser el cuero cabelludo con poliéster trenzado codificado 3.0 y desinfectar la piel con un 1% de yodo y un 70% de isopropilo.

Para aflojar la nariz y la barra bucal, y luego las dos barras de los oídos, para retirar suavemente al animal del instrumento estereotáxico. En este momento administrar analgesia y, si es necesario, un agente de reversión de la anestesia. Luego, coloque a la rata en una jaula limpia en una placa calefactora configurada a 38 grados centígrados y vigílela de cerca hasta que se despierte.

Después de la cirugía, se puede estudiar la cinética de la neurodegeneración en todo el animal mediante pruebas de comportamiento e imágenes PET y, después del sacrificio, utilizando técnicas inmunohistoquímicas. La prueba cilíndrica para evaluar el uso espontáneo de las extremidades anteriores se realizó en varios momentos después de la microinyección de AAV recombinante que expresa la mutación A53T alfa sinucleína en la sustancia negra. A partir de tres semanas después de la inyección, se observó un deterioro motor significativo en las ratas que recibieron la dosis media.

A las cuatro semanas después de la inyección, se observó una disminución del 50% en el uso espontáneo de la pata delantera contralateral. Mientras que los animales inyectados con eGFP de control no mostraron asimetría en el uso de las patas delanteras. Las ratas que recibieron una dosis más alta de alfa sinucleína recombinante AAV 2/7A53T mostraron un deterioro más pronunciado del uso de las patas delanteras a los 29 días después de la inyección.

Para demostrar que la discapacidad motora observada era dependiente de la dopamina, se administró una dosis única de L-doba. Cuando se repitió la prueba del cilindro 45 minutos después del tratamiento con L-dopa, se observó una recuperación completa del uso de la pata delantera en los animales inyectados con alfa sinucleína AAV 2/7A53T recombinante. Para hacer un seguimiento no invasivo de la cinética de la neurodegeneración dopaminérgica nigrostriatal a lo largo del tiempo, en animales individuales, la unión transportada por dopamina se cuantificó mediante tomografía por emisión de positrones en animales pequeños con F-18FECT como radioligando.

La unión a DAT disminuyó significativamente en el budimán caudado ipsilateral de ratas recombinantes con AAV 2/7A53T alfa sinucleína inyectadas con el tiempo a lo largo del tiempo. Después de 32 días, se observó una disminución en la unión de DAT de hasta el 85%. Como control positivo, la inyección de la neurotoxina 6 OHDA en el SN indujo una pérdida del 90% de la unión a DAT en siete días.

Secciones cerebrales de ratas microinyectadas con alfa sinucleína recombinante AAV 2/7A53T a lo largo del tiempo se inmunoteñieron con tirosina hidroxilasa, un marcador de neuronas dopaminérgicas. Esta figura demuestra la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas durante un período de 29 días después de la microinyección. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en 45 minutos.

Al intentar este procedimiento, es importante utilizar coincidencias vectoriales finales de alta calidad. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como la PET no invasiva, el análisis del comportamiento y el análisis inmunohistoquímico para determinar el nivel de neurodegeneración y neuropatología. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar una inyección de vector viral en la sustancia negra para desarrollar modelos animales basados en vectores virales para la enfermedad de Parkinson.

No olvide que trabajar con vectores virales puede ser peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como trabajar bajo un flujo laminar y una descontaminación adecuada de los residuos siguiendo este procedimiento.