Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

El objetivo general de este procedimiento es manipular el impacto de las entradas sinápticas en el procesamiento neuronal mediante inyecciones microiontoforéticas de sustancias neuroactivas en animales despiertos. Este método puede ayudar a desentrañar funcionalidades clave utilizando sistemas sensoriales, como el papel de los neurotransmisores y su interacción con los estímulos sensoriales y la codificación. La principal ventaja de esta técnica es que permite manipular las entradas sinápticas locales en la pestaña y el estudio de los sistemas moduladores neuronales sin verse afectados por la anestesia.

Aunque este procedimiento se realizó aquí en ratones restringuidos, también puede utilizarse en otros mamíferos como murciélagos, ratas o conejillos de Indias. Para comenzar este procedimiento, coloque los alambres de tungsteno en una herramienta de alineación construida a medida para el corte. Fije cuidadosamente los extremos sueltos de los alambres con cinta adhesiva y córtelos a la longitud deseada.

A continuación, tire suavemente de la cinta para retirar los alambres de tungsteno de la herramienta de alineación, asegurándose de que todos los alambres permanezcan adheridos a la cinta. Luego, enrolle la cinta sobre un mandril de latón pulido y mantenga los alambres firmemente contra el mandril para garantizar una buena conexión eléctrica.

A continuación, conecte el husillo a un motor de 5 RPM en la estación de trabajo. El acceso al husillo está inclinado a 45 grados con respecto a la superficie de la solución de ataque. Posteriormente, sumerja un tercio de los alambres en la solución.

A continuación, sumerja un electrodo de varilla de carbono en el baño de ataque para cerrar el circuito. Encienda la estación de trabajo para que el eje comience a girar, luego ajuste la corriente que pasa a través de los electrodos y la solución de ataque a 250 miliamperios. Detenga el ataque de la punta cuando la corriente disminuya a 200 miliamperios con el fin de tallar las puntas del alambre en puntos muy finos.

Ahora, coloque un alambre en una capilar de vidrio de borosilicato con su extremo inferior bloqueado con arcilla para modelar. Sostenga la pipeta utilizando una bobina calefactora y un émbolo suspendido. Fije el alambre recubierto de vidrio a un portaobjetos antes de colocarlo bajo el microscopio.

Coloque la punta y toque la perla de ácido bórico para enfocarla. Luego caliente la perla hasta que se derrita ligeramente. Después, inserte aproximadamente de 10 a 15 micrones de la punta del alambre y apague los potenciómetros de calentamiento.

A medida que la perla se enfría, retire el vidrio de la punta del electrodo para exponer el tungsteno. Para obtener una punta de aproximadamente 15 milímetros, configure el polar con los parámetros adecuados. Tire del capilar para obtener dos pipetas con la punta aislada.

Coloque una pipeta de polo sobre un portaobjetos utilizando arcilla de modelado y rompa su punta con tijeras finas, pinzas o el lado plano de un escalpelo. Ajuste ligeramente el ángulo entre el electrodo y el cabezal múltiple para obtener una mejor unión y un conjunto más delgado. Bajo el microscopio, alinee cuidadosamente el electrodo de tungsteno sobre la punta del cabezal múltiple.

Una vez alineado, baje el electrodo hasta que haga contacto con el multicanal. Encajándolo en la ranura entre los dos canales superiores, deslice luego la punta del electrodo hasta que sobresalga entre 15 y 20 micrómetros desde la punta del multicanal. Aplique ahora una pequeña gota de adhesivo curable con luz sobre el conjunto del electrodo de tungsteno y el multicanal, aproximadamente a 5 milímetros de sus puntas.

Evite que el pegamento alcance las puntas para no obstruir los canales de múltiples conductos y cure el pegamento utilizando una lámpara de luz azul LED. Ahora, coloque el animal anestesiado sobre una manta calefactora para mantener su temperatura a 38 grados Celsius y estabilice la cabeza del animal en un marco estereotáxico con dos barras para los oídos y una barra para morder. A continuación, aplique gel oftálmico para proteger los ojos. Luego, afeite el cuero cabelludo y aplique povidona yodo para desinfectar la piel. Con un bisturí, realice una incisión a lo largo de la línea media para exponer el cráneo y retrate el periósteo que cubre los huesos parietales y la parte más rostral de los huesos occipitales.

A continuación, aplique una capa delgada de adhesivo curable con luz sobre el cráneo y la base del poste para la cabeza. Espere 10 segundos y coloque el poste sobre la región rostral de los huesos parietales a lo largo de la línea media. Utilice una fuente de luz azul para curar el adhesivo durante 20 segundos y lograr una resistencia efectiva de la unión.

Posteriormente, taladre dos orificios alrededor y detrás de la base del poste craneal utilizando una broca pequeña. Coloque un tornillo de relojero en un orificio taladrado para servir como punto de contacto adicional entre el cráneo y la etapa craneal. Gire un giro y medio para ajustar firmemente los tornillos y pruebe con pinzas para asegurarse de que no estén sueltos.

Luego, inserte la punta del alambre de plata del electrodo de tierra en el tercer orificio y asegúrese de que haga contacto con la dura. Aplique una pequeña gota de adhesivo de cianocrilato resistente al agua para unir el alambre al cráneo. Posteriormente, aplique un composite curable con luz para reforzar la unión del poste cefálico con el cráneo, cubriendo la base del poste cefálico, la parte inferior del alambre de plata y los tornillos.

Tenga cuidado de no extenderse más allá de lambda para permitir el acceso durante la grabación y cure el material compuesto utilizando una fuente de luz azul. Luego, retraccione el músculo en la parte posterior del cuello cerca de su inserción en el cráneo. Usando un trepano pequeño, taladre una ventana redonda justo debajo de la sutura lambda y lateral a la línea media para exponer el colículo inferior.

En este procedimiento, coloque el cuerpo del animal en un sujetador personalizado acolchado con espuma. Fije la pieza de sujeción del cráneo a un soporte unido al marco estereotáxico. Este es un buen momento para administrarle al animal una recompensa líquida.

A continuación, cubra el cuerpo del animal con una manta de algodón y sujétela ligeramente usando un hemi-cilindro de plástico y cinta adhesiva. Utilice una jeringa con una punta flexible para llenar los cilindros con las sustancias elegidas. Con el micromanipulador, coloque el electrodo de múltiples cilindros en su soporte.

A continuación, coloque un alambre de plata sin codificar dentro de cada cilindro de modo que un extremo haga contacto con la solución y el otro extremo quede accesible. Luego, conecte esos extremos al dispositivo de microiontoforesis. Después, conecte el terminal positivo al extremo del electrodo de tungsteno y el terminal de tierra al alambre de plata que hace contacto con la duramadre.

Posteriormente, mueva el electrodo de múltiples barriles hasta que la punta entre en contacto con la superficie del cerebro. Aplique solución salina estéril tibia para prevenir la desecación del tejido cerebral. En ese momento, aplique una corriente de retención para evitar la fuga de fármaco desde la punta del barril mientras busca actividad de unidad individual.

Registre la actividad neural y la aplicación iontoforética de gabazina. Aquí se muestra el área de respuesta a la frecuencia de cuatro neuronas registradas en el colículo inferior antes y durante la inyección microiontoforética de gabazina. Las cruces negras indican las frecuencias elegidas para presentarse como sonidos raros y repetitivos.

Aquí se muestran los histogramas acumulados de tiempo periestímulo de la respuesta neural a todas las frecuencias e intensidades presentadas para construir el área de respuesta antes y durante la inyección de gabazina. Las barras negras indican la duración del sonido. Aquí se presentan los mapas de puntos de la respuesta de potenciales de acción a un par de frecuencias presentadas como estímulo raro en rojo y estímulo repetitivo en azul, antes y durante la aplicación de gabazina.

El fondo sombreado indica la duración del estímulo. Estos mapas de puntos muestran las respuestas cuando se invirtieron las probabilidades relativas de las parafrecuencias. Este gráfico muestra las respuestas de una sola neurona a siete pares de frecuencias presentadas como sonido raro y sonido repetitivo antes y durante la aplicación de gabazina.

Y este gráfico muestra los índices SSA de la respuesta neural a sonidos raros y repetitivos medidos antes y durante la aplicación de gabazina. Una vez dominado, el procedimiento descrito permite ajustar los parámetros específicos según la estructura neural y el tipo de neurona de interés. Al intentar grabaciones en animales con sujeción de la cabeza, es fundamental recordar que el tiempo de grabación está determinado y limitado por el nivel de habituación del animal, pero una ventaja importante es que se pueden realizar múltiples incisiones de grabación en el mismo animal durante varios días, minimizando así el número de animales utilizados.

Al realizar microiontoforesis utilizando electrodos gemelos, se pueden combinar otros procedimientos, como inyecciones de transistores neuronales, con el fin de responder preguntas adicionales, como el origen de las entradas y el objetivo de proyección de las neuronas dentro del sitio de registro. Un aspecto crítico al trabajar con animales despiertos es su bienestar; por lo tanto, nunca exceda la cantidad de tiempo de recordatorio aprobado en su protocolo y monitoree constantemente en busca de cualquier signo de malestar. De ser así, debe detener el registro inmediatamente.