Desarrollo de una In Vitro Ensayo para evaluar la función contráctil de las células mesenquimales que la transición epitelio-mesenquimal Sufrió

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la contractilidad de las células mesenquimales que han sufrido una transición mesenquimal epitelial inducida por citocinas inflamatorias in vitro, o EMT. Este mesénquima es una variación de la función celular básica después de la EMT inducida por respuestas inmunitarias inflamatorias, como durante la fibrosis pulmonar idiopática o la remodelación de las vías respiratorias en el asma grave. Las principales ventajas de esta técnica son que no requiere de dispositivos específicos y que demuestra un alto contenido de desmontaje

Comience lavando un cultivo de células epiteliales pulmonares humanas A-549 con cinco a diez mililitros de PBS. A continuación, separe las células adherentes con dos milímetros de tripsina-EDTA a 37 grados centígrados y un cinco por ciento de dióxido de carbono. Después de tres minutos, transfiera la suspensión celular a tubos cónicos que contengan medio de cultivo celular y centrifuga las células en una centrífuga.

Vuelva a suspender los gránulos en dos milímetros de medio de cultivo celular, reservando un pequeño elocuente para el recuento. A continuación, siembre de 0,5 a 1 veces 10 a la sexta célula en diez milímetros de medio por placa de poliestiérreno de diez centímetros e incube los cultivos celulares durante 24 horas. Para la inducción de EMT, al día siguiente, trate las células con 10 microlitros de TGF beta 1 y TNF alfa, y devuelva las placas a la incubadora durante otras 48 horas.

Al cuarto día, lavar los cultivos inducidos por emt con cinco a diez mililitros de pbs, luego separar las células con tripsina-EDTA como se acaba de demostrar. A continuación, centrifuga las suspensiones celulares en DMEM suplementado con inhibidor de tripsina y vuelve a suspender los gránulos en 500 microlitros de pbs. A continuación, cuente las células y añada el medio de gell recién preparado hasta una densidad de 3 veces 10 a la 5ª célula por pocillo, mezclando suave pero rápidamente la solución con pipeta antes de la gelificación.

Con prontitud, pero con cuidado, dispense 0,5 mililitros de células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos no tratada en formas cilíndricas ordenadas. A continuación, coloque la placa en una incubadora de cultivos celulares durante 15 minutos. Cuando el gel se haya solidificado por completo, mueva una espátula esterilizada en un círculo alrededor del exterior de cada gel en una dirección, para separar los geles de las placas sin que se rompan.

Al retirar el gel, tenga cuidado de no mover la espátula hacia adelante y hacia atrás en el pozo. A continuación, utilice la espátula para transferir suavemente los geles a placas individuales de cultivo de tejidos de 16 milímetros que contengan cinco mililitros de DMEM suplementados con un uno por ciento de FBS, con o sin TGF beta 1 y TNF alfa. Finalmente, agite suavemente los platos para asegurarse de que los geles floten en el medio y devuelva los geles a la incubadora de cultivos celulares.

Las células a541 no tratadas muestran una apariencia en forma de adoquín y triángulo, característica de las células epiteliales. Sin embargo, después de su estimulación con TGF beta 1 y TNF alfa, las células muestran una forma de huso alargada, similar a la observada para las células mesinfémicas. La QRTCPR de la expresión de los marcadores epiteliales y mesincémicos antes y después de la EMT revela que las células A541 tratadas con citocinas inflamatorias durante 48 horas exhiben una expresión significativamente reducida de CDH1 y una expresión significativamente aumentada de VIAM y ACTA2.

Además, la estimulación con estas citocinas atenúa la expresión de E-cadherina determinada por el análisis de sangre occidental, mientras que se inducen las expresiones de vimentina, N-cadherina y actina alfa del músculo liso. En un ensayo de contracción en gel, después de 48 horas, los geles que contienen células tratadas con TGF beta 1 y TNF alfa son más pequeños que los geles controlados que contienen células tratadas con PBS. De hecho, después de 72 horas, el tamaño de los geles que contienen los geles tratados con citocinas se reduce significativamente, en comparación con los geles controlados medidos por un analizador de geles.

Como se observó, los pasos de contracción del gel se pueden completar en tres horas si se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar confirmar que la EMT se ha inducido con éxito antes de realizar el ensayo de contracción del gel. Después de la observación, esta técnica proporciona una forma de variar el proceso de EMT durante un estado inflamatorio como la fibrosis o el remodelado pulmonar.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo emitir células que tienen EMT, en un tipo de cuagenter y espumarlas en medio.