La evaluación simultánea de los cardiomiocitos de síntesis de ADN y la ploidía: Un Método de Ayuda a la cuantificación de los cardiomiocitos Regeneración y Facturación

El objetivo general de este protocolo es cuantificar el recambio de cardiomiocitos mediante el etiquetado prolongado con nucleósidos y citometría de flujo para cuantificar los núcleos de cardiomiocitos nuevos, teniendo en cuenta la poliploidización de los núcleos. Este método puede utilizarse para abordar preguntas clave en el campo de la regeneración de cardiomiocitos y puede emplearse como una herramienta de cribado para cuantificar los cambios en la dinámica de generación de cardiomiocitos. La principal ventaja de este protocolo es que permite una cuantificación sensible y precisa de la generación de nuevos cardiomiocitos, independientemente de la fuente celular y controlando la poliploidización.

24 horas después de la sexta inyección de EdU, coloque el animal tratado en posición supina y use tijeras quirúrgicas para realizar una incisión en la piel desde el abdomen medio hasta el diafragma. A continuación, sosteniendo el esternón alejado de la cavidad corporal, corte bilateralmente el diafragma para exponer el corazón. Luego levante ligeramente el corazón y corte los principales vasos sanguíneos del tracto de salida para diseccionar el corazón de la cavidad torácica.

Inmediatamente después de la recolección, coloque los corazones en tubos cónicos individuales de 15 mL que contengan 10 mL de PBS enfriado a cuatro grados Celsius. Luego transfiera las muestras a placas de Petri individuales de 10 cm y use un escalpelo para cortar cada corazón en dos piezas en orientación sagital. A continuación, exprima suavemente las piezas del corazón con un par de pinzas.

Retire ambas piezas del corazón y colóquelas en una placa de Petri que contenga 20 mL de PBS fresco. Repita nuevamente con una placa de Petri nueva y 20 mL de PBS fresco. Coloque ambas partes del corazón en el mismo tubo microcentrífugo de 1,5 mL y utilice una aguja de calibre 25 para hacer un pequeño orificio en la tapa de cada tubo, a fin de evitar que se abra cuando el corazón haya sido procesado.

Luego etiquete cada tubo y congele los tejidos cardíacos en un recipiente con nitrógeno líquido. Para cada corazón que se analice, incube 36 mL de BSA al uno por ciento y PBS en un tubo para ultracentrífuga. Deseche la solución después de 30 minutos.

Una vez que los tubos se hayan secado al aire, añada 10 mL de solución de gradiente de sacarosa a cada tubo. Después de cortar individualmente las muestras de corazón congeladas en nitrógeno líquido con el bisturí, transfiera los fragmentos de tejido de cada corazón a tubos cónicos individuales de 50 mL que contengan 15 mL de tampón de lisis celular. Homogenice las muestras durante 15 segundos a 25.000 rpm con un homogenizador de sonda a temperatura ambiente.

Luego agregue 15 mL adicionales de tampón de lisis a cada tubo y transfiera las muestras una a la vez a un dounce de 40 mL con un pistilo de gran holgura. Realice 10 movimientos con el pistilo y filtre las suspensiones celulares a través de un tamiz de 100 micrones, seguido de un tamiz celular de 40 micrones, hacia tubos cónicos individuales de 50 mL. Luego, recopile los pellets nucleares cardíacos mediante centrifugación y resuspenda las células en 25 mL de solución de gradiente de sacarosa cada una.

Coloque las células encima del gradiente de sacarosa libre de núcleos en los tubos de ultracentrífuga preparados y centrifugue las capas utilizando un rotor de brazo oscilante. Tras la centrifugación, reconstituya los pellet de núcleos en 1.300 microlitros de tampón de almacenamiento de núcleos y transfiera los núcleos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL etiquetado como PCM1. Transfiera 300 microlitros de cada suspensión desde los tubos PCM1 a un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 700 microlitros de tampón fresco de almacenamiento de núcleos y etiquete como control ISO.

A continuación, marque los núcleos de PCM1 con el anticuerpo anti-PCM1 y los núcleos de control ISO con el anticuerpo de control isotípico IgG rápido durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, centrifugue las muestras y resuspenda los pellet en un mL de tampón de almacenamiento de núcleos fresco para una segunda centrifugación bajo las mismas condiciones. Después de la segunda centrifugación, resuspenda los pellet en un mL de tampón de almacenamiento de núcleos fresco e incube los núcleos con un microlitro de un fragmento F(ab')2 conjugado con fitc procedente de un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo durante una hora a cuatro grados Celsius en la oscuridad.

Para evaluar el grado de incorporación de EdU, centrifugar las suspensiones de núcleos marcados con PCM1 y control ISO y resuspender los pellets en un mL de PBS con 1 % de BSA dos veces para dos lavados consecutivos. Después del segundo lavado, reemplazar el sobrenadante con 100 microlitros de fijador de EdU e incubar las muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la fijación, lavar los núcleos dos veces más en un mL de PBS con BSA, luego incubar las muestras con 100 microlitros de solución permeabilizante a base de saponina a temperatura ambiente.

Después de 15 minutos, agregue 500 microlitros de la mezcla de etiquetado de EdU recién preparada a cada tubo para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, centrifugue las muestras tres veces, lavando los núcleos con un mL de PBS BSA durante las dos últimas centrifugaciones. Finalmente, etiquete las muestras con 400 microlitros de la solución de tinción de ADN.

El análisis inmunohistoquímico de los corazones estimulados demuestra la presencia de cardiomiocitos que expresan PCM1 y que han incorporado EdU. Sin embargo, los datos obtenidos mediante métodos inmunohistoquímicos pueden interpretarse erróneamente, ya que otros tipos celulares que han incorporado EdU podrían identificarse incorrectamente como cardiomiocitos. En un estudio con ratones mdx y controles, el análisis mediante citometría de flujo descrito en este protocolo permite una cuantificación rápida de la generación de nuevos núcleos en cardiomiocitos, excluyendo al mismo tiempo las células que han incorporado EdU durante la despoliploidización.

De manera similar a los datos publicados previamente, en este experimento representativo se observó un aumento en las tasas de generación de núcleos de nuevos cardiomiocitos en corazones de ratones mdx en comparación con controles de edad comparable. Una vez dominada esta técnica, puede completarse en cuatro horas a lo largo de dos días. Al realizar este procedimiento, es importante recordar incluir ambos controles negativos, EdU y PCM1, para que las compuertas puedan establecerse con precisión durante el análisis.

Esta técnica también es compatible con varias técnicas inmunohistoquímicas adicionales posteriores, lo que permite cuantificar la incorporación de nucleocitos en varios tipos celulares cardíacos diferentes. Esta técnica se ha utilizado en el campo de la investigación cardiovascular para estudiar los cambios en la regeneración de cardiomiocitos en el modelo mdx de cardiopatía no isquémica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar rápidamente los núcleos de neo-cardiomiocitos, observar el recuento para detectar poliploidización y detectar cambios en la regeneración y renovación de cardiomiocitos.