La denervación quirúrgica cutánea: Un método para probar el requisito de nervios en el ratón modelos de enfermedad de la piel

El objetivo general de este procedimiento es examinar la influencia de los nervios en la piel normal y patológica. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en la biología de la piel normal, como si los nervios cutáneos afectan la homeostasis y la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que permite comparar muestras de piel intacta y desinervada obtenidas del mismo animal.

La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que los nervios pueden ser difíciles de reconocer y extraer con daño mínimo a los tejidos circundantes. Primero, anestesie al ratón y verifique que haya alcanzado el nivel adecuado de sedación mediante una compresión del dedo del pie. Asimismo, confirme que el ratón presente respiración y latido cardíaco normales.

Ahora coloque al animal sobre una almohadilla térmica en un área quirúrgica aséptica. Con una afeitadora eléctrica, retire cuidadosamente el vello del lado dorsal donde se tomará la biopsia. Luego limpie el área afeitada utilizando toallitas con Betadine y alcohol.

Asegúrese de que todos los recortes de cabello se hayan eliminado del sitio. Ahora, delinee el sitio de biopsia utilizando un marcador negro. Para obtener secciones longitudinales de los folículos pilosos, el borde más largo de la biopsia debe extenderse en dirección anterior a posterior, parasetidal a la línea media dorsal.

Con un escalpelo, realice una escisión de espesor completo sin dañar la fascia muscular subyacente. Habitualmente, la hemorragia es mínima. La muestra de biopsia debe incluir la epidermis, la dermis, la grasa subcutánea y el pánico carnoso.

Aplane la muestra de piel extirpada sobre una toalla de papel seca, con el lado de la dermis hacia abajo. Recorte el exceso de toalla de papel y almacene la muestra en TBS frío durante hasta una hora si es necesario recolectar otras muestras. Regresando al ratón, sutúre el sitio de biopsia utilizando 60 suturas de nylon separadas aproximadamente tres milímetros entre sí.

Luego, supervise al ratón en una jaula de recuperación hasta que recupere la conciencia. Utilice analgésicos de acuerdo con las normas institucionales designadas de cuidado animal y siga sus directrices si el ratón muestra signos de malestar. Entre siete y 10 días después de la cirugía, retire los puntos de sutura.

Continúe con el procesamiento de las biopsias para histología o tinción en montaje completo. Anestesie al animal, afeite toda la piel dorsal y limpie el área de manera similar al procedimiento de biopsia. A continuación, realice una incisión usando un escalpelo estéril a lo largo de la línea media dorsal, desde la base del cuello hasta aproximadamente medio centímetro por encima de la cola.

Con pinzas estériles romas, retire suavemente la piel del lado izquierdo alejándola del flanco para visualizar el tejido subyacente desde las almohadillas de grasa escapular cerca del cuello hasta justo por encima de la extremidad trasera. Ahora identifique el nervio cutáneo dorsal bajo un microscopio estereoscópico. Estos aparecen como haces blancos que discurren en dirección caudal a través de la fascia translúcida de la pared del tronco antes de realizar giros bruscos y penetrar en el tejido conectivo laxo situado debajo de la piel.

A continuación, utilizando pinzas ultrafinas, retire el nervio exclusivamente del lado izquierdo del animal ubicado en los sitios anatómicos T3 a T12, extrayéndolos desde donde sus segmentos se doblan en la pared del tronco hasta sus puntos de entrada en la piel. Oriente las pinzas verticalmente y sujete los nervios aproximadamente medio centímetro por debajo de sus puntos de doblez. Una vez sujetos, tire hacia arriba para estirar los nervios y separarlos del tejido circundante y así extraerlos.

Evite dañar los vasos sanguíneos adyacentes. Asegúrese de mantener el tejido húmedo durante todo el procedimiento aplicando periódicamente gotas de solución salina al 0,9%. Continúe eliminando todos los nervios que se extienden desde la pared del tronco hasta la piel, pero no interrumpa los nervios dentro de la fascia densa de la pared del tronco.

A continuación, retire todos los nervios del colgajo de piel expuesto. Estas fibras comprenden las ramas distales del nervio cutáneo dorsal y aparecen como filamentos blancos ramificados ubicados de forma esporádica dentro del tejido conectivo en el lado dérmico del colgajo de piel. Para eliminar estas ramas finas, coloque la pinza aproximadamente paralela a la superficie dérmica, agarre el nervio y extraiga hacia arriba.

Elimine todos los nervios visibles de esta manera. No perfore los vasos sanguíneos ni la piel. Durante este paso, es importante evitar romper los vasos sanguíneos adyacentes.

Si encuentra un nervio con un vaso sanguíneo adyacente, sígalo hasta una zona donde no haya un vaso adyacente y elimínelo arrancándolo. Ahora, afloje la piel en el lado derecho de la incisión en la línea media dorsal, pero no elimine ningún nervio. Esto servirá como control operatorio simulado contralateral.

Finalmente, suturar al animal y monitorear postoperatoriamente como antes. Posteriormente, para confirmar la pérdida estable de los nervios, semanas después de la cirugía, pinchar suavemente el área deservada utilizando una aguja hipodérmica estéril. Observar si el animal responde, típicamente estremeciéndose o girando la cabeza.

Si el área de la piel ha sido deservada de forma estable, el animal presentará poca o ninguna respuesta. Obtenga biopsias de piel del área sin respuesta y del lado contralateral simulado para obtener muestras apareadas experimentales y de control. De las biopsias, es importante tomar varias secciones histológicas para identificar posibles diferencias en la abundancia o morfología de las cúpulas táctiles entre las muestras simuladas y las deservadas.

La cepa de ratón glebe one cree ERT2 permite dirigir la recombinación genética inducida por tamoxifeno a áreas de la piel que muestran una alta actividad de la vía hedgehog, como los epitelios de las cúpulas táctiles. Estos ratones se cruzaron con ratones indicadores inducibles abolaxi para visualizar los epitelios de las cúpulas táctiles. Los nódulos son cruciales para mantener tanto las cúpulas táctiles normales como sus células de Merkel asociadas.

Esto se demuestra experimentalmente mediante la pérdida gradual de la morfología normal de la cúpula táctil, así como por la pérdida de células depositadas de queratina ocho tras la desinervación. Los nervios también son cruciales para promover la señalización hedgehog en la cúpula táctil, tal como se monitorea mediante la expresión de Glebe one cree ERE2 y la tinción colectiva de beta lateral en montajes de piel tanto simulada como desinervada. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ablacionar quirúrgicamente los nervios cutáneos dorsales para probar si estos nervios participan en la función normal de la piel o si modulan alguna enfermedad.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse de forma rutinaria y confiable con un estrés mínimo para el animal. Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar métodos como la tinción fluorescente amino para confirmar si los nervios han sido completamente ablacionados de la piel y si la expresión génica se está viendo afectada.