Stencil Micropatterning de las células madre pluripotentes para el sondeo Organización Espacial de la diferenciación Parcas

El objetivo general de este método de micropatrón basado en plantilla, para células madre pluripotentes humanas, es proporcionar un medio sencillo y robusto para generar gradientes ambientales espaciales que controlen los patrones de diferenciación de las células madre. Este método puede ayudarle a responder preguntas clave sobre el patrón de tejidos utilizando un modelo de células madre humanas, como la forma en que los gradientes espaciales en las fuerzas de adhesión célula-célula y célula-matriz extracelular pueden contribuir a organizar los destinos de diferenciación de las células madre. La ventaja de este método es que no requiere modificaciones adicionales de la superficie para generar patrones adhesivos de matriz extracelular a los que las células puedan adherirse.

Esto significa que el método es compatible con diversas configuraciones de matriz extracelular y sustratos, específicas para cada línea celular. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de micropatrones son difíciles de aprender debido a que requieren un manejo preciso y cuidadoso del esténcil y las células.

Para este procedimiento, los esténciles de PTMS ya deben estar diseñados y fabricados. Asimismo, tener células EFC humanas creciendo en matriz de membrana basal, de manera que las colonias estén listas para la siembra más adelante en el procedimiento. Para comenzar, cargue un recipiente con 700 microlitros de etanol al 70% grado analítico, en agua ultra pura.

Luego, coloque la plantilla de PDMS sobre la solución y coloque el recipiente en un gabinete de seguridad biológica para que se seque durante la noche. Al día siguiente, verifique que no se hayan formado burbujas bajo la plantilla. A continuación, prepare el recipiente hasta que las células puedan sembrarse sobre la plantilla.

Prepare un alícuota de matriz de membrana basal de calidad para CSE humanas añadiendo 16,7 mililitros de DMEM/F12 para obtener una solución 1,5x y manténgala en hielo. Trate el sustrato con 100 vatios de plasma de oxígeno durante 90 segundos. No abra el recipiente hasta que esté dentro de la cámara de plasma y tápelo rápidamente después del tratamiento.

Este tratamiento evitará que se formen burbujas cuando el sustrato se sumerja en la solución. A continuación, cubra la plantilla con 450 microlitros de la solución preparada de matriz de membrana basal 1,5x. Luego, selle el recipiente con parafilm e incúbelo durante cinco horas.

Antes de continuar, revise las placas de seis pocillos con colonias de HESC preparadas. Identifique y aspire las colonias de células diferenciadas que hayan perdido su morfología típica de HESC. Estas deben aparecer redondeadas, con una morfología epitelial estrechamente empaquetada y con una alta relación núcleo-citoplasma y nucleolos prominentes.

A continuación, lave cada pocillo de células cultivadas con dos mililitros de DMEM/F12 dos veces. Después del segundo lavado, añada un mililitro de enzimas digestivas a cada pocillo, como la acutasa, e incube la placa durante ocho minutos a 37 grados Celsius. Tras la incubación, golpee suavemente la placa para desprender todas las colonias del sustrato.

A continuación, lave cada pocillo con al menos cuatro mililitros de medio por cada mililitro de enzima digestiva aplicada al pocillo, y recoja las suspensiones celulares en un único tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue las células a 200 g durante tres minutos a temperatura ambiente para formar un botón celular. Luego aspire el sobrenadante y re-suspenda las células en 400 microlitros de medio de mantenimiento para HESC, suplementado con 10 micromolar de inhibidor de ROCK.

Triturar suavemente las células tres veces para deshacer los agregados. A continuación, ajustar la densidad de las suspensiones. Mezclar bien y realizar una dilución de 1:20 de 200 microlitros en medio.

Cuente las células en la dilución utilizando un hemocitómetro. Luego, diluya la suspensión principal según sea necesario, usando medio con inhibidor de rock. Para continuar, agregue el número requerido de células sobre cada plantilla preparada.

Debe depositarse solo una monocapa de células, por lo que deben distribuirse uniformemente. Deje el esténcil en reposo durante cinco minutos para que las células se asienten. Luego, transfiera con cuidado los esténciles cargados a un incubador, manteniendo las placas niveladas durante toda la transferencia.

Deje que las células se adhieran a las plantillas durante una incubación de una hora. Después de permitir que las células se adhieran, examínelas bajo un microscopio para asegurarse de que lo hicieron adecuadamente. Transfiera la plantilla de vuelta a la cabina, y aspire las células no adheridas de la plantilla.

A continuación, agregue dos mililitros de agente tensoactivo no iónico compatible al 0,5 % en DMF12 a la zona que rodea la plantilla. Agite suavemente la solución para cubrir la plantilla. Luego, utilice un par de pinzas autoclavadas para retirar suavemente la plantilla del recipiente.

Después de retirar la plantilla, inspeccione las células micropatrón bajo un microscopio. El surfactante no iónico evita que estas células se sequen. Deje que las células micropatrón incuben en la solución de medio suplementado con surfactante durante 10 minutos a 37 grados Celsius.

Después de 10 minutos, aspire la solución y lave la placa con dos mililitros de medio DMEM/F12 normal, tres veces. Tras los lavados, añada dos mililitros de medio de mantenimiento de HESC con inhibidor de ROCK. Inspeccione nuevamente las células para verificar que los micropatrones se hayan formado correctamente.

A continuación, incubar las células a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, aspirar el medio, lavar las células una vez con DMF12 y luego agregar dos mililitros de medio de diferenciación suplementado, para inducir a las células a diferenciarse en mesoendodermo. Posteriormente, analizar los resultados.

La fabricación del esténcil celular mediante un cortador láser proporcionó características de 1000 micrones. El esténcil estaba compuesto por una lámina delgada de esténcil con orificios pasantes micropatrón, y una junta de PDMS utilizada para contener las células. Mediante esta herramienta, se investigaron ESHCs micropatrón durante la diferenciación en mesoendodermo.

Los bordes de las colonias de H9-HESC presentan adhesiones de integrina más altas que las células en el interior de la colonia. Por lo tanto, las células se diferencian en células de mesoendodermo positivas para brachiary T cuando se inducen con activina, BMP4 y FGF2. Cuando estas células se organizaron en monocapas con diferentes geometrías, las formas geométricas y las curvaturas convexas con ángulos rectos condujeron a una concentración local de fuerzas de tracción mediadas por integrina, lo que resultó en un aumento de la diferenciación hacia mesoendodermo.

La intensidad de expresión de T en diferentes localizaciones dentro de una colonia individual mostró que el grado de inducción de mesoendodermo fue efectivamente mayor en las esquinas agudas de colonias cuadradas y rectangulares, y en las curvaturas convexas de un arco semicircular. Esto demuestra que las fuerzas mecánicas mediadas por la adhesión celular pueden modularse mediante el método descrito. Antes de realizar el procedimiento, es importante optimizar el tiempo de recubrimiento de la matriz, así como el tiempo de digestión y de adhesión celular, para la línea específica de células madre pluripotentes humanas con la que se esté trabajando.