Brecha ocasiones intercelular de comunicación: un biomarcador funcional para evaluar los efectos adversos de las sustancias tóxicas y toxinas, y de Salud Beneficios de Productos Naturales
25 de diciembre de 2016
Este protocolo describe una técnica de transferencia de carga de tintes fluorescentes bisturí que mide la comunicación intercelular a través de canales brecha de la salida. Brecha de comunicación intercelular de la unión es un proceso celular importante mediante el cual se mantiene la homeostasis del tejido y la interrupción de esta señalización celular tiene efectos adversos para la salud.
El objetivo general es proporcionar un ensayo simple para medir la comunicación intercelular de unión gap a través de una población de células de mamíferos que pueda satisfacer una amplia gama de necesidades farmacológicas y toxicológicas in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la toxicología, como si un compuesto afecta el desarrollo o el mantenimiento de un tejido, al desregular la comunicación intercelular de la unión gap. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece una evaluación sencilla y rápida de la función de la unión gap en una gran población de células en respuesta a tóxicos y toxinas.
La demostradora del procedimiento estará a cargo de Ajna Uzuni, asistente de investigación de pregrado de mi laboratorio. Para comenzar el experimento, siembre tres veces 10 a la quinta células epiteliales de hígado de rata WB-F344 en placas de cultivo de 35 milímetros de diámetro que contenían medio modificado de Eagle más 5% de suero fetal-bovino. Cultivar las células en una incubadora hasta que alcancen el 100% de confluencia y continuar con el tratamiento experimental de las células.
Para continuar con los experimentos de dosis-respuesta, agregue 10 microlitros y 20 microlitros de una solución madre de fenantreno de dos milimolares previamente preparada en acetonitrilo al 100%, y cuatro microlitros, seis microlitros y ocho microlitros de una solución madre de 20 milimolares de fenantreno en acetonitrilo al 100% a tres placas de células que contengan dos mililitros de medio de crecimiento por cada volumen agregado de solución madre. A continuación, agregue cuatro microlitros, seis microlitros, ocho microlitros, 10 microlitros y 20 microlitros de una solución al 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contengan dos mililitros de medio de crecimiento por cada volumen agregado de solución de acetonitrilo para que sirva como control del vehículo. Después de agregar el acetonitrilo, incubar las placas.
Para realizar experimentos de respuesta al tiempo, agregue siete microlitros de una solución madre de 20 milimolares de fenantreno en acetonitrilo al 100% a tres placas de células, que contienen dos mililitros de medio de crecimiento para cada punto de tiempo. A continuación, añada siete microlitros de acetonitrilo al 100% a tres placas de células, que contengan dos mililitros de medio de crecimiento para cada punto de tiempo, para que sirvan como vehículo de control. Incuba las placas para cada punto de tiempo designado.
Deseche el medio de cultivo vertiéndolo suavemente. Enjuague las células con tres mililitros de PBS y decante o aspire entre enjuagues. Pipetear un mililitro de un miligramo por mililitro de colorante amarillo lucifer disuelto en PBS en cada placa celular.
Precargue el tinte en las células pellizcando el bisturí entre el dedo índice y el pulgar. Coloque el bisturí perpendicular a y a cinco milímetros del borde de la placa de cultivo y luego use la gravedad para permitir que el bisturí ruede suavemente desde este ángulo perpendicular a un ángulo de 15 grados. Haga rodar la cuchilla a través de una población de celdas en tres áreas diferentes de la placa total.
A continuación, incube las células con la solución LY durante tres minutos a temperatura ambiente. Decantar o aspirar el LY y enjuagar las células para eliminar todo el tinte extracelular y eliminar la fluorescencia de fondo extracelular. A continuación, añada 0,5 mililitros de una solución de formalina tamponada con fosfato al 4% para fijar las células.
Visualice las células fijas utilizando un microscopio de epifluorescencia con un aumento de 200x. Alinee todas las placas de modo que la línea de indentación sea paralela al campo de visión horizontal. Se generaron una serie de imágenes SL-DT de células epiteliales hepáticas de rata WB-F344 tratadas con dosis crecientes de fenantreno.
La disminución en la migración del colorante fluorescente amarillo lucifer es causada por el aumento de las dosis de fenantreno, lo que demuestra la creciente inhibición inducida por tóxicos de la comunicación intercelular de unión gap, o GJIC. La fracción del control, o valores de FOC, obtenidos de las imágenes SL-DT se promedió, se analizó estadísticamente y luego se graficó. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como Western blots de proteínas de transducción única, para responder a preguntas adicionales.
Por ejemplo, ¿estos compuestos activan eventos mitogénicos de perforación celular?
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Descripción general
Este protocolo describe una técnica de carga con bisturí y transferencia de colorante fluorescente que mide la comunicación intercelular a través de canales de uniones en hendidura. Este método proporciona un ensayo sencillo para evaluar la comunicación intercelular mediante uniones en hendidura en células de mamíferos, lo cual es fundamental para comprender la homeostasis tisular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Toxicología
Antecedentes
- La comunicación intercelular por uniones en hendidura es esencial para mantener la homeostasis tisular.
- La alteración de esta comunicación puede provocar efectos adversos sobre la salud.
- Esta técnica permite una evaluación rápida de la función de las uniones en hendidura.
- Puede aplicarse en diversos estudios farmacológicos y toxicológicos.
Objetivo del estudio
- Medir los efectos de compuestos sobre la comunicación intercelular por uniones en hendidura.
- Proporcionar un método confiable para evaluar el desarrollo y mantenimiento de tejidos.
- Facilitar la investigación en toxicología respecto al impacto de toxinas sobre la comunicación celular.
Métodos Utilizados
- Siembre células epiteliales hepáticas de rata WB-F344 en placas de cultivo.
- Cultive las células hasta alcanzar una confluencia del 100 %.
- Aplique tratamientos experimentales a las células.
- Utilice la transferencia de colorante fluorescente para evaluar la comunicación intercelular.
Resultados principales
- La técnica permite evaluar la función de las uniones en hendidura en poblaciones grandes de células.
- Proporciona información sobre cómo los tóxicos afectan la comunicación intercelular.
- Eficacia demostrada en diversos estudios in vitro.
- Un protocolo rápido y sencillo mejora la eficiencia de la investigación.
Conclusiones
- Este método es una herramienta valiosa para la investigación toxicológica.
- Contribuye a comprender el papel de las uniones en hendidura en la salud del tejido.
- Estudios futuros pueden ampliar sus aplicaciones en farmacología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La comunicación intercelular por uniones en hendidura (GJIC) sirve como un biomarcador funcional para evaluar la alteración de la homeostasis tisular por agentes tóxicos y para analizar los efectos protectores de productos naturales. La técnica de carga con bisturí y transferencia de colorante fluorescente (SL-DT) permite una evaluación rápida a nivel poblacional de la inhibición de la GJIC, apoyando la eliminación de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Este ensayo proporciona una confianza predictiva para priorizar compuestos según su impacto en las vías de comunicación celular críticas para la función orgánica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la exposición a compuestos con la alteración de la comunicación intercelular mediada por uniones en hendidura como mecanismo de toxicidad.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas a través de la medición directa de la actividad de los canales intercelulares en poblaciones de células vivas.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar biomarcadores tempranos de efectos adversos sobre el mantenimiento y la homeostasis de los tejidos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante el establecimiento de la competencia basal en la comunicación intercelular por uniones en hendidura (GJIC).
- Valor operativo: Proporciona lecturas cuantitativas estandarizadas de transferencia de colorante, adecuadas para automatización e imágenes de alto rendimiento.
- Escalabilidad: Adaptado para cortes de tejido in vivo y compatible con microscopía de fluorescencia automatizada para aumentar el rendimiento de muestras.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica mediante mecanismos conservados de CICJ en diferentes especies.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Aclara si los fenotipos observados se deben a una comunicación intercelular alterada en lugar de efectos fuera del blanco.
- Decisiones Ajustadas al Riesgo: Orienta los criterios de avance al cuantificar las relaciones estructura-actividad en la modulación de la CICJ.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo SL-DT funciona como una herramienta en la etapa de descubrimiento para obtener información mecanicista, ubicado antes de la optimización del fármaco candidato, con el fin de filtrar compuestos con alto riesgo de alteración tisular.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de cómo los tóxicos o productos naturales alteran las redes de señalización intercelular.
- Selección: Proporciona disponibilidad de ensayos mediante lecturas funcionales reproducibles y basadas en poblaciones que reflejan la comunicación a nivel tisular.
- Análisis: Genera valores de fracción del control (FOC) que permiten comparaciones estadísticas entre diferentes dosis y puntos temporales.
- Investigación Traductiva: Se alinea con estrategias de biomarcadores al vincular la función de la comunicación mediante uniones en hendidura (GJIC) con resultados de integridad tisular en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Sirve como una plataforma reutilizable en programas de desarrollo en toxicología, farmacología y nutracéuticos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al proporcionar una lectura funcional directa de la actividad de los canales de uniones en hendidura.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y la reproducibilidad mediante la carga sencilla con bisturí y la obtención de imágenes en un punto final fijo.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al vincular la alteración temprana de la comunicación mediada por uniones en hendidura con efectos adversos tisulares posteriores.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo al identificar compuestos que preservan la homeostasis de la comunicación intercelular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, manejo de colorantes fluorescentes y microscopía de epifluorescencia.
- Depende de una técnica estandarizada con bisturí y tiempos de incubación consistentes para una transferencia confiable del colorante.
- Necesita un acuerdo entre los miembros del equipo sobre los umbrales de análisis de imágenes y los parámetros morfométricos.
- Adaptable a diferentes tipos de células mamíferas y cortes de tejido mediante la optimización de los parámetros de carga y fijación.
- Limitado a la evaluación de la actividad funcional de los canales; no distingue entre la expresión de conexinas, su fosforilación o sus estados de compuerta.
