Adenofection: Un método para estudiar el papel de las chaperonas moleculares en Morfodinámica celular mediante experimentos de reducción-Rescate

El objetivo general de este método es permitir la realización de experimentos de rescate por agotamiento en condiciones que preserven la integridad celular y la homeostasis de proteínas para análisis funcionales de procesos biológicos a nivel de célula individual.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las funciones de las proteínas y los requisitos estructurales en la dinámica celular, como la mitosis y la diferenciación celular. La principal ventaja de esta técnica consiste en agotar una proteína de interés y reintroducir al mismo tiempo una variante de dicha proteína a un nivel cercano al fisiológico en la mayoría de una población celular.

Comience recubriendo las placas con fondo de vidrio con fibronectina. Para ello, diluya un stock de fibronectina de un miligramo por mililitro uno a 100 con PBS estéril.

Añada un mililitro a cada placa de 35 mililitros para cubrir toda la superficie. Incube durante una hora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Durante la incubación, precaliente el MEM alfa suplementado con 10% de FBS y un alícuota de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 grados Celsius.

Después de 45 minutos de incubación, comience a preparar la solución de células. Aspire el medio de una placa de 10 centímetros de células HeLa-RFP-H2B y enjuague suavemente dos veces con 1,5 mililitros de tripsina-EDTA al 0,05 %.

Deje 0.5 mililitros de tripsina EDTA en la placa después de la última aspiración e incube las células durante dos a tres minutos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Toque suavemente la placa y observe la capa celular bajo el microscopio para verificar que todas las células se hayan desprendido. A continuación, agregue 10 mililitros de medio y pipetee suavemente varias veces para separar las células y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros.

Cuente una muestra de 10 microlitros de la suspensión celular utilizando un hemocitómetro. A continuación, aspire la solución de fibronectina de los platillos con fondo de vidrio. No permita que la fibronectina se seque antes de sembrar las células.

Prepare una solución de suspensión celular para sembrar 1,5 veces diez a la quinta células por placa de 35 milímetros en dos mililitros de medio. Siembre una placa de 35 milímetros adicional al número de condiciones para contar el número de células antes de la transducción viral. Incube de 30 a 45 minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, revise las células bajo el microscopio para asegurarse de que estén bien separadas, como se observa aquí. Devuelva las placas al incubador y cultive las células hasta el día siguiente.

Al día siguiente de la siembra, asegúrese de que las células hayan alcanzado una densidad de al menos el 50 %. Una densidad celular inferior al 50 % provoca una disminución en la eficiencia de transducción viral, un aumento en la variación de la expresión proteica por célula y una mayor toxicidad celular. A continuación, recolecte las células del pocillo adicional sembrado como antes y cuente el número de células. Calcule el volumen de virus necesario para una transducción eficiente de las células. Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cada condición y añada 400 microlitros de alfa MEM tibio sin suero. Después de descongelar lentamente las alícuotas de virus sobre hielo, añada el volumen requerido de cada virus a los tubos y mezcle suavemente mediante pipeteo. A continuación, tras aspirar el medio de las células, añada cuidadosamente la mezcla de virus gota a gota. Incube las células a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono. Cada 15 minutos durante un período de una hora, agite suavemente las placas bajo la campana estéril para cubrir las células con el virus. El uso de una pequeña cantidad de medio facilita el contacto del virus con las células.

Después de la incubación, pipetee suavemente 1,6 mililitros de MEM alfa sin suero a cada placa para obtener un volumen total de dos mililitros. Luego inicie la sincronización celular añadiendo timidina 2 milimolar antes de incubar las células durante dos horas adicionales.

Mientras tanto, prepare la mezcla de transfección de ARNip añadiendo en un microtubo 139 microlitros de agua estéril, 50 microlitros de cloruro de calcio uno molar y 11 microlitros de ARNip veinte micromolar. Si no es necesario el ARNip, reemplace la cantidad de ARNip por agua estéril para realizar una transfección vacía. Añada la solución HBSS-2X gota a gota lentamente sobre la mezcla de cloruro de calcio y ARNip. Mezcle suavemente dos veces mediante inyección de aire utilizando una pipeta de 200 microlitros, ya que los precipitados más pequeños resultan en una mayor eficiencia de transfección. Incube luego la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, añada lentamente 200 microlitros gota a gota a cada placa y agite para mezclar. Incube las placas a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono durante 16 horas.

Al día siguiente, retire las placas del incubador y llévelas a una campana de cultivo de tejidos. Después de lavar las células dos veces con dos mililitros de HEPES tibio, agregue dos mililitros de alfa MEM sin antes devolver al incubador.

Siete horas después, agregue timidina dos milimolar a las placas antes de devolverlas al incubador. Trabaje con no más de cuatro placas celulares a la vez, ya que las variaciones de temperatura afectan la duración del ciclo celular. Al día siguiente, 48 horas después de la transfección con siRNA y la infección viral, enjuague las células dos veces con dos mililitros de PBS tibio y luego agregue dos mililitros de MEM alfa sin rojo de fenol para la imagenología de células vivas. Incube durante siete horas.

Realice experimentos de microscopía en células vivas a corto plazo en células mitóticas con un microscopio invertido equipado con una cámara humidificada regulada térmicamente con 5% de dióxido de carbono. Antes de la adquisición, verifique que la cámara haya alcanzado la temperatura adecuada de 37 grados Celsius.

Coloque las placas de cultivo en la cámara del microscopio una hora antes de la adquisición para permitir el equilibrio adecuado del medio y evitar desviaciones del enfoque debidas a cambios de temperatura. Examine el estado mitótico de las células. En este momento, entre el 10 y el 15 % de las células deben encontrarse en las etapas iniciales de la mitosis.

Durante el tiempo de equilibrio, configure los parámetros de adquisición según lo determinado en experimentos previos. Es importante lograr una resolución adecuada sin provocar fotoblanqueo, ya que esto causa daño celular y altera la progresión mitótica. Elija varios campos que contengan células en la entrada mitótica por condición para obtener un número significativo de células para analizar sin exceder el intervalo de adquisición. Una vez seleccionados todos los campos, restablezca el enfoque e inicie la adquisición lo más rápido posible.

Utilizando un sistema confocal de disco giratorio, una configuración típica incluiría cuatro condiciones diferentes, siete campos por placa y dos canales de color con un intervalo de uno con cinco a dos minutos durante un período de 75 minutos. Determine criterios bien definidos para analizar fenotipos mitóticos en células, lo cual dependerá de los marcadores fluorescentes que se utilicen.

En contraste con la transfección de BAG3-GFP con ADN plasmídico, como se observa a la izquierda, la adenofección con adenovirus recombinantes, mostrada aquí a la derecha, permite una expresión más homogénea y eficiente de BAG3-GFP en la mayoría de la población celular a baja multiplicidad de infección. Este inmunotransferencia representativo muestra que la adenofección con siARN específicos para BAG3 y el adenovirus recombinante BAG3-GFP permite un agotamiento eficiente del BAG3 endógeno y la reintroducción de la proteína BAG3-GFP a niveles cercanos a los endógenos. Como se muestra aquí, la adenofección puede preservar la homeostasis proteica, ya que no se detecta un aumento en los niveles de las proteínas de choque térmico inducidas por estrés en células HeLa que han sido adenofectadas, a diferencia de las células HeLa tratadas con el inductor de estrés proteotóxico MG132. Aquí observamos que la progresión de las células a través de la mitosis no se ve significativamente alterada por la adenofección, tal como se muestra en estas imágenes confocales de lapso de tiempo de células HeLa adenofectadas con siARN de control y BacMam-GFP alfa Tubulina, y BacMam-RFP Actina.

El gráfico indica la proporción de células con mitosis anormal. Las células adenofectadas solo con siRNA específico para BAG3 mostraron un aumento aproximado de dos veces en el nivel de defectos mitóticos, representado por la barra roja, el cual se restauró a niveles cercanos al de las células control mediante la reintroducción de BAG3-GFP, mostrado por la barra negra.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo realizar experimentos de rescate por depleción utilizando adenofección. Este método proporciona un sistema rápido y sencillo para crear silenciamientos hipomórficos destinados al análisis estructura-función en múltiples contextos celulares. Siguiendo este método, se pueden identificar los requisitos estructurales clave del proteína de interés para una función determinada. Luego, se pueden utilizar otros enfoques de edición genómica para profundizar en los mecanismos implicados.