Un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis TEM

El objetivo general de este procedimiento es preparar muestras con un bajo número de células para realizar análisis mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) de manera eficiente y reproducible. Este método puede ayudar a revelar todas las estructuras de células reales y condiciones fisiológicas más cercanas a la realidad en el campo biomédico. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden obtener resultados tanto cualitativos como cuantitativos a partir de un bajo número de células de forma reproducible.

Para comenzar, utilice un citómetro de flujo para separar 10.000 células madre hematopoyéticas, o CMH, en un tubo microcentrífugo de 1,5 mL que contenga 600 microlitros de medio de Iscoves modificado de Dulbecco con 10 % de FBS. Usando una centrífuga con rotor de balanceo, centrifugue las CMH separadas a 1.000 × g durante 10 minutos.

Utilice aspiración suave para eliminar todo el medio excepto 200 microlitros. Para fijar las células, agregue 0,2 mL de una solución fijadora recién preparada al doble de concentración (2X) e incube a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, agregue 600 microlitros de tampón cacodilato 0,1 molar para lavar las células.

Centrifugue las células nuevamente, esta vez a 30 grados Celsius. Luego, tras la centrifugación y después de eliminar todo el tampón excepto 200 microlitros, agregue 200 microlitros de azul de Evans a dos miligramos por mililitro en tampón cacodilato, e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para teñir las células. Use 600 microlitros de tampón cacodilato 0,1 molar para lavar las células tres veces.

Luego, resuspenda las células en los 200 microlitros restantes de tampón antes de transferir la suspensión celular a un tubo de 0,5 mL. En este paso, el precipitado debe ser visible en el tubo. Con una centrífuga de banco, centrifugue las células a 1.000 ×g durante 10 minutos.

Luego, retire suavemente el tampón sin perturbar el pequeño pellet celular ahora visible, dejando 50 microlitros de tampón en el tubo. Prepare una solución de agarosa al 4 %, agregando 200 miligramos de agarosa de baja fusión a cinco mililitros de tampón cacodilato 0,1 molar en un tubo de 15 mL. Derrita la agarosa transfiriendo el tubo al agua hirviendo en un frasco de vidrio de 100 mL.

Añada 200 microlitros de la solución de agarosa al tubo de la suspensión celular. Centrifugue inmediatamente a 1.000 ×g y 30 grados Celsius durante 10 minutos. Después de confirmar que las células se han sedimentado en la agarosa semisólida en el fondo del tubo, transfiera inmediatamente el tubo a cuatro grados Celsius, o hielo, durante 20 minutos para solidificar la agarosa.

Usando una aguja de 27 gauge, transfiera cuidadosamente el agarosa solidificado, que contiene el sedimento celular, a una placa de Petri plástica de 35 mL que contenga tampón cacodilato 0,1 molar. Con un escalpelo, corte el agarosa solidificado que contiene el sedimento celular en un solo trozo de aproximadamente uno a dos milímetros. Luego, transfiéralo a un nuevo tubo de 1,5 mL.

Añada 600 microlitros de tampón cacodilato 0,1 molar y lave el pellet celular de agarosa utilizando una pipeta para añadir y retirar el tampón. Retire el tampón del pellet celular de agarosa y, en una campana extractora, utilizando ropa protectora y guantes, añada un mililitro de solución de tetraóxido de osmio al 1%. Incube el pellet celular a cuatro grados Celsius durante una hora.

Después de la incubación, lave la muestra tres veces. Trasfiera la muestra a un vial de vidrio de 20 mL con tapa. A continuación, deshidrate la muestra utilizando una serie de etanol.

Luego, infiltre la muestra con concentraciones crecientes de resina LX 112 en etanol antes de incubarla dos veces en resina al 100 % durante 60 minutos cada vez. Utilizando pinzas, transfiera cuidadosamente la muestra al fondo de un molde de goma con forma de punta de pirámide y añada resina pura encima de la muestra para llenar el molde. Incube la muestra a 60 grados Celsius durante 72 horas para polimerizar la resina.

Una vez que la resina esté polimerizada, retírela de los moldes girando el molde de goma. Debe ser visible un pequeño grupo negro de células en la pirámide de resina polimerizada. Utilice cianoacrilato para fijar la pirámide de resina polimerizada sobre un cilindro de montaje para el corte en secciones.

Después de montar el bloque en un ultramicrotomo, utilice una cuchilla de afeitar y un cuchillo de diamante para recortar el bloque piramidal, formando una figura trapezoidal corta y ancha con la parte superior e inferior del bloque paralelas entre sí, y con los lados uniformemente angulados. A continuación, use el cuchillo de diamante para recortar el bloque alrededor del pellet celular y retire las secciones de plástico alrededor del trozo de agarosa con el pellet celular. Con el ultramicrotomo, corte secciones de un micrómetro y utilice una herramienta de pestaña y un asa metálica para transferir las secciones desde la cubeta de agua hasta un portaobjetos de vidrio.

Luego, coloque los portaobjetos sobre una placa calefactora a 37 grados Celsius para secarlos. Utilizando una jeringa con un filtro de 0,22 micrómetros, agregue una gota de solución de azul de toluidina a las secciones e incube durante tres minutos. A continuación, enjuague los portaobjetos con agua destilada y deje secar las secciones.

Después del secado, revise las secciones bajo un microscopio óptico para identificar la posición de las células. A continuación, use un cuchillo de diamante para cortar secciones ultradelgadas. Luego, con una herramienta de pestaña, transfiera de dos a tres secciones a rejillas de 200 mallas desde la cubeta de agua y colóquelas en una placa de Petri de vidrio.

Transfiera el recipiente con rejillas a una placa calefactora a 30 grados Celsius durante 30 minutos para secar las secciones. Añada gotas de acetato de uranilo al 1 % y incube a temperatura ambiente durante 10 minutos para teñir las rejillas. Luego, use agua destilada para enjuagar de seis a ocho veces.

Tiña con citrato de plomo de Reynolds a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de enjuagar de seis a ocho veces. Transfiera la placa de vidrio que contiene las rejillas a una placa calefactora a 37 grados Celsius para secar las secciones. Finalmente, analice las secciones con un microscopio electrónico a 87 kilovoltios.

Se muestran aquí a baja magnificación secciones semifinas teñidas con azul de toluidina procedentes de bloques que contienen un pequeño pellet celular, lo que confirma un grupo de células. Esta imagen de mayor aumento muestra la morfología intacta de las células. Esta figura representa un campo general del grupo celular a partir de secciones ultradelgadas teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo, y analizadas mediante microscopía electrónica.

Se muestra aquí una única CTH, lo que demuestra que la morfología y la ultraestructura de las células se conservaron adecuadamente. Una micrografía electrónica de mayor aumento muestra con gran detalle las ultraestructuras intracelulares de una CTH individual. Además, imágenes de alto aumento capturaron con buena definición la estructura y la integridad de orgánulos subcelulares, como las mitocondrias.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco a seis horas, y para la tinción azul avanzada, el embebido en agarosa y el posterior procesamiento normal de MET, se requieren de cinco a seis días si se realiza adecuadamente. Así que, tras ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo preparar muestras a partir de células reales para el análisis por MET.