La observación y cuantificación de la conducta de apareamiento en el nematodo del pino, Bursaphelenchus xylophilus

El objetivo general de este procedimiento es observar el comportamiento de apareamiento del nematodo del pino, Bursaphelenchus xylophilus. Este método puede ayudar a avanzar en los estudios psicológicos del nematodo. Se ocupa específicamente de la observación del comportamiento de apareamiento del nematodo del pino.

La principal ventaja de esta técnica es que se pueden obtener adultos vírgenes, lo que hace que sea mucho más fácil observar el comportamiento de apareamiento de los adultos. Las implicaciones de esta técnica se extienden puramente hacia el estudio más amplio de los nematodos, ya que tienen comportamientos de ciclos de vida similares. Para la demostración de este método es fundamental, ya que la adquisición de nematodos adultos vírgenes es difícil porque las restricciones de los nematodos en desarrollo requieren práctica y no es fácil distinguir con precisión los machos de las hembras en los juveniles de la primera etapa temprana.

Para cultivar nematodos de la madera de pino, primero prepare placas de agar papa dextrosa. Para inocular una placa, perfore un trozo de estera fúngica con un diámetro de 10 milímetros de una estera de betritus senaria y colóquela en el centro de una nueva placa PDA. Cultive la alfombra de hongos durante cinco días a 25 grados centígrados en la oscuridad.

Después de cinco días, agregue los nematodos de la madera de pino a la placa de Petri preparada y cultívelos durante tres días a 25 grados centígrados en la oscuridad. Para aislar los nematodos del hongo, primero prepare una herramienta de recolección. Coloque un tubo de goma con abrazadera debajo de un embudo y sostenga el embudo preparado en una rejilla para ensamblar el aparato de embudo de Baermann.

Luego, coloque dos capas de papel de filtro en lugar de gasa en la boca del embudo. Ahora, transfiera los cultivos de hongos a la configuración del embudo y agregue agua hasta que la alfombra de hongos esté sumergida. Después de dos horas, los nematodos saldrán del cultivo de hongos, atravesarán el papel de filtro y se asentarán en la parte más baja del embudo de Baermann.

Recoja los nematodos colocando un tubo de 15 mililitros debajo del embudo, luego suelte lentamente la pinza para recolectar unas gotas de agua, que contendrá los nematodos. Centrifugar las colecciones de nematodos a 3.000 g durante dos minutos a temperatura ambiente. Luego separe el nivel superior de agua y vuelva a suspender los gusanos en un mililitro de agua.

Transfiera la suspensión de los nematodos a un plato de vidrio de seis centímetros y agregue tres mililitros de agua para ayudar a los nematodos a nadar libremente. Ahora, recolecta huevos para hacer caldos vírgenes. Transfiera el plato a una incubadora oscura y deje que las hembras embarazadas pongan huevos durante 10 minutos.

Debido a su superficie glicoproteica, los huevos se pegarán al vaso. A continuación, retire el agua con los gusanos con cuidado para evitar perturbar los huevos pegados al plato. Luego, agregue rápidamente 3 mililitros de agua al plato para evitar que los huevos se sequen.

Repite este proceso de limpieza de huevos al menos tres veces, para eliminar todas las larvas y adultos y obtener los huevos puros. A la recolección de huevos puros lavados, agregue cinco mililitros de agua y proceda a desarrollar los huevos en la oscuridad a 25 grados centígrados. 24 horas después de comenzar el cultivo de huevos, recoja las larvas J2 eclosionadas.

Transfiera con cuidado las larvas J2 a un tubo de 15 mililitros. A continuación, centrifugar la colección a 3.000 g durante dos minutos. Separe la capa superior de agua y agregue nuevamente 200 microlitros de agua.

Luego, cultive las larvas J2 en una placa PDA preparada con una estera de hongos. Después de 52 horas, la mayoría de las larvas J2 se habrán convertido en larvas J4 en etapa temprana. Montar un embudo de Baermann, y extraer los nematodos de los cultivos fúngicos durante dos horas, como se ha descrito anteriormente.

Mientras esperas, prepara una aguja para recoger los gusanos. Saque una punta de un capilar de vidrio calentado sobre un quemador de alcohol. La punta debe tener unas 50 micras de diámetro, aproximadamente el ancho del cuerpo de un nematodo adulto.

Después de dos horas, transfiera las larvas J4 a una placa de Petri limpia como se describió anteriormente. Ahora, sexar los nematodos bajo un microscopio estereoscópico. Alrededor de dos tercios de las larvas suelen ser hembras.

La vulva de la hembra es obviamente diferente de la anatomía del macho, pero debido a que los gusanos son muy activos, el sexado requerirá práctica. El paso más crítico de este protocolo es distinguir y separar con precisión a los machos de las hembras en la primera etapa temprana. De lo contrario, habrá mezcla y maldad, una vez que se conviertan en adultos.

Y eso dificulta la observación del apareamiento. Poco a poco, recoja y transfiera los gusanos a una gota de agua en un tobogán para machos o hembras. Para garantizar el éxito, dos personas diferentes deben verificar dos veces la asignación de sexo.

Ahora, transfiera la gota de agua que contiene los gusanos sexados a la placa de cultivo de hongos adecuada. Luego, cultiva a las vírgenes durante otras 24 horas antes de estudiar su comportamiento de apareamiento. Para observar el comportamiento de apareamiento de los nematodos del pino, primero prepare varios portaobjetos cóncavos agregando 200 microlitros de agua a cada uno de sus pozos.

A continuación, elija un solo adulto virgen preparado y transfiéralo a un portaobjetos preparado. Mantenga a los adultos vírgenes dentro del pozo durante una hora para que se adapten al nuevo ambiente acuoso. Después de una hora, agregue un solo adulto virgen del sexo opuesto al pozo, usando una pipeta.

A continuación, observe el comportamiento de apareamiento bajo un microscopio estereoscópico y filme el comportamiento para el análisis cuantitativo. Todo el proceso de apareamiento suele terminar en dos horas. Cada 30 minutos, añade 50 microlitros de agua para compensar la evaporación.

Para investigar la elección de apareamiento y la competencia intersexual, agrupe y observe nematodos vírgenes de dos combinaciones diferentes. La tasa de éxito de apareamiento de los adultos vírgenes fue de alrededor del 87%, que fue mucho más alta que la de los adultos seleccionados al azar. Las parejas tardaron un promedio de 83 minutos en completar todo el proceso de apareamiento, que contiene cuatro fases diferentes.

Buscando, contactando, copulando y permaneciendo. Dentro de estas fases, se pueden observar muchos patrones específicos de comportamiento. Cuando una hembra se encontraba con varios machos, había una elección obvia de apareamiento.

La hembra generalmente usa su cabeza para contactar a un macho, generalmente en la cabeza, el cuerpo, la cola y la región genital. La hembra entonces copulaba con el macho, o lo dejaba rápidamente, y nadaba hacia otro macho. Se midieron las tasas de éxito de apareamiento después del primer contacto para las diferentes combinaciones de nematodos.

También se produjo la competencia intersexual. Cuando una hembra virgen se mezclaba con tres machos vírgenes, los machos trataban de acercarse y contactar a la hembra tanto como fuera posible, para tener la oportunidad de aparearse con ella. Cuando la vulva estaba ocupada, los otros machos trataban de perturbar el proceso de apareamiento mediante violentos balanceos corporales o arrastrándolos para separarlos.

Se observó que la competencia intersexual femenina era más o menos similar a la competencia intersexual masculina. Debido a la competencia intersexual, las frecuencias de cópula realizadas con las diferentes combinaciones fueron significativamente diferentes. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la exploración de la ecología del comportamiento en nematodos.

Una vez dominado, este procedimiento se puede completar en 12 días, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar separar con precisión a los machos de las hembras, los primeros cuatro juveniles en etapa para obtener adultos vírgenes.