Inmunohistoquímica en secciones de parafina de la epidermis del ratón Utilizando anticuerpos fluorescentes

En la epidermis. La inmunohistoquímica es un medio eficaz para localizar proteínas específicas en su compartimento de expresión. En este video, demostramos un método confiable para la inmunolocalización de proteínas en la epidermis, que utilizamos rutinariamente en nuestro laboratorio.

Hola, soy Tammy del Laboratorio del Dr. Turin, ubicado en el edificio bajo del Instituto de Investigación en Salud de Ottawa, en el programa de enfermedades crónicas. Hoy les mostraremos un procedimiento de inmunohistoquímica utilizando anticuerpos fluorescentes en secciones de tejido embebido en parafina del epitelio epidérmico de ratón. En nuestro laboratorio, hemos optimizado protocolos para la inmunolocalización de marcadores de diferenciación epidérmica utilizando tejido fijado con BO'S.

Como parte de la optimización, mantenemos la piel plana colocándola sobre una toalla de papel antes de la fijación. Este procedimiento incluye la disección, fijación del epitelio, deshidratación, inclusión en parafina, corte de secciones, desparafinado, rehidratación, revelado de antígenos, marcado con anticuerpos y, finalmente, montaje y visualización mediante fluorescencia epiescopia. Así que comencemos.

Al utilizar ratones neonatos, no hay necesidad de afeitar la piel de la espalda. Sin embargo, cuando se tienen ratones mayores que tienen pelo, es necesario afeitar la piel de la espalda para que no interfiera al cortar las secciones. Durante la disección, debe tener mucho cuidado de no colocar la pinza en las áreas de la piel que desea utilizar para su ensayo.

Entonces, lo que hacemos es colocar la pinza alrededor del borde del lugar donde vamos a cortar, luego levantamos con mucho cuidado y cortamos la epidermis, recordando no tocar el área que deseamos utilizar para nuestro experimento. Al fijar la piel, no queremos que se enrolle ni que quede dentro del tubo. Queremos que quede bien plana.

Lo que hacemos para ayudar a ello es colocar la piel sobre una toalla de papel para que permanezca plana durante la fijación. Ahora que tenemos la piel bien plana sobre la toalla de papel, cortamos los bordes o los recortamos para eliminar las partes que pudimos dañar con la pinza. Luego, se corta la piel en trozos muy pequeños de aproximadamente dos milímetros por dos milímetros.

Ahora el tejido va a ser fijado. Después de cortar la piel en trozos manejables, sumérjala en la solución de boína. Tape los tubos, envuélvalos con perfil y colóquelos en un agitador rotatorio.

Para una incubación nocturna, es importante incubar solo entre 16 y 18 horas en la solución boin. Períodos de fijación más cortos o más largos dañarán su tejido. La incubación ha finalizado.

Enjuague el tejido con PBS y luego mediante una serie de lavados con etanol usando alcohol al 30 %, 50 % y 70 %. Puede observar que el BO es de color amarillo y que, a medida que realiza los lavados, a medida que el BO se diluye, el color del lavado se vuelve cada vez menos amarillo. Lave dos veces, durante 30 minutos cada vez.

Después del último lavado en etanol, las muestras se colocan en etanol fresco al 70% y pueden almacenarse a cuatro grados Celsius hasta su posterior procesamiento, incluyendo unos pocos ventileos de parafina. Inclusión. Una ventaja del uso de tejidos congelados es que la integridad del tejido es superior y las muestras pueden almacenarse durante largos períodos de tiempo. En general, las instalaciones centrales generan resultados más reproducibles.

Sin embargo, si se cuenta con las instalaciones y un operador dedicado que posea la experiencia necesaria, los cortes pueden realizarse internamente. Aprender a realizar buenos cortes es más bien una forma de arte. Por lo tanto, utilizamos una instalación centralizada.

Después de recibir las láminas de regreso del laboratorio central, puede observarse que la parafina está presente en ellas. Como una película delgada, las láminas se colocan en una gradilla envuelta con papel de aluminio, tal como una papa horneada, e incubar durante cinco minutos a 55 grados. Una vez finalizada la incubación, desenrolle rápidamente las láminas y colóquelas en tolueno para tres lavados de cinco minutos cada uno.

Es muy importante recordar que estos lavados de cinco minutos deben estar bien cronometrados, ya que una incubación demasiado larga hará que el tolueno no sea adecuado para sus muestras. Después de sus tres lavados y el tolueno, realice un enjuague rápido en etanol al cien por ciento. Dado que el etanol y el tolueno forman un precipitado que interferirá con su experimento, este es un paso muy importante que debe recordar.

A continuación, las muestras se rehidratan incubando los portaobjetos cinco minutos en etanol al 95 %, cinco minutos en etanol al 70 % y luego dos veces cinco minutos en agua. En este punto, los tejidos pueden procesarse para tinción con hematoxilina y eosina. También utilizamos la instalación central para este fin.

Para la exposición del antígeno, coloque 500 ml de tampón citrato al 1x en un vaso de plástico de un litro e introduzca sus portaobjetos. Recuerde retirar el mango metálico y coloque el vaso en el microondas. Somete a microondas a potencia máxima dos veces durante cinco minutos cada vez.

Recuerde abrir la puerta para enfriar el microondas entre sus dos incubaciones. Una vez finalizado el calentamiento en el microondas, retire los portaobjetos del tampón citrato hirviendo y colóquelos en un recipiente para tinción que contenga agua tibia. Utilizamos simplemente agua corriente tibia, y el propósito de este paso es enfriar lentamente los portaobjetos desde la ebullición hasta la temperatura ambiente.

Ahora puede lavar las laminillas tres veces durante cinco minutos en PBS y estaremos listos para comenzar con la inmunohistoquímica. Lo primero que debemos hacer para iniciar la tinción inmunológica es secar la zona alrededor de nuestras muestras con un trozo de papel absorbente. Con el fin de evitar la contaminación cruzada de anticuerpos, delimitamos el área alrededor de nuestras muestras con un repelente líquido.

Prepare una cámara humedecida colocando un papel de filtro en una placa de Petri. Humedézcala con agua, elimine el exceso de agua e introduzca sus portaobjetos. La razón por la que utilizamos una cámara humedecida es asegurar que durante nuestros períodos de incubación los portaobjetos no se sequen.

Es muy importante que los portaobjetos no se sequen porque el secado aumentará su fondo. En este momento, los portaobjetos se bloquean con tampón de incubación durante 30 minutos. Después del bloqueo, transfiera sus portaobjetos de vuelta al portaportaobjetos e incube en tampón de lavado.

Elimine el exceso de tampón tal como lo hizo anteriormente. Vuelva a colocar la laminilla en la cámara humidificada e incube con el anticuerpo primario durante una hora a temperatura ambiente.

Una vez finalizada la incubación de una hora, coloque nuevamente las laminillas en el portaportas y lávelas con tampón de lavado tres veces durante 10 minutos cada una. Después de los lavados, retire el exceso de tampón de lavado alrededor de la muestra con papel de tejido. Vuelva a colocar las laminillas en la cámara humidificada e incube durante una hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario; tras la incubación con el anticuerpo secundario, lave con tres cambios de tampón de lavado, cada uno de 15 minutos.

A continuación, lavamos tres veces durante cinco minutos. En PBS, elimine cualquier líquido excesivo que rodee la muestra y seque el PBS desde la parte posterior del portaobjetos para montar las cubiertas sobre el portaobjetos. Utilizamos móvil con DAB al 2,5% co.

Para reducir el desvanecimiento, agregue 80 microlitros gota a gota sobre los portaobjetos. Tenga cuidado de no introducir burbujas. Luego, baje lentamente un cubreobjetos.

Teniendo cuidado de no dejar burbujas. Las burbujas son perjudiciales porque a menudo quedan justo sobre su espécimen, precisamente donde desea tomar sus imágenes después de que su preparación esté seca. Ahora está listo para observar sus preparaciones.

Aquí se muestra una tinción exitosa utilizando un filtro FITC. Con un objetivo de 20 x, observamos la claudina seis asociada con todas las capas suprabasales de la epidermis. Nuestro laboratorio tiene un gran interés en la expresión y localización de las claudinas en la epidermis.

Con respecto a las uniones estrechas y la formación de la barrera de permeabilidad epidérmica, acabamos de mostrarle cómo realizar inmunohistoquímica en piel de ratón. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que se desea que sus secciones de tejido estén planas y que debe asegurarse de que sus portaobjetos no se sequen entre las incubaciones. Eso es todo.

Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.