El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

El objetivo general del aislamiento magnético de microglía mediante CD11b es obtener un rendimiento final de microglía posnatal con alta pureza en un período de tiempo relativamente corto, para permitir experimentaciones versátiles in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como los mecanismos de señalización relacionados con la inflamación neural. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos disponibles actualmente es que el aislamiento toma aproximadamente 30 minutos, sin comprometer la pureza, el rendimiento ni la viabilidad.

Comience transfiriendo las cabezas recién decapitadas de crías de ratón de uno a dos días de edad a una cabina de flujo laminar. Luego, utilice tijeras microquirúrgicas rectas de 4,5 pulgadas para hacer una pequeña incisión en el cráneo y las meninges insertando las puntas en la abertura formada por la decapitación y cortando de caudal a rostral. Después de realizar la incisión, retire uno de los hemisferios hacia un lado.

Luego, utilice un par de pinzas curvas o con gancho para extraer todo el cerebro. Transfiera el cerebro a un tubo de 50 mililitros que contenga dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,25% e incube durante 15 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius. Lave el cerebro con medio de crecimiento fresco agregando y eliminando el medio.

Tras finalizar los lavados, agregue dos mililitros de medio de crecimiento por cerebro e homogenice triturando el cerebro. Cuando el tejido cerebral no disminuya de tamaño, cambie a una pipeta con una abertura más pequeña. Al final de la trituración, cuando la suspensión esté clara y no se observen grumos, pase la suspensión a través de un filtro celular de 70 micrones para obtener un cultivo de células individuales.

Luego, pipetee de ocho a nueve mililitros de medio de crecimiento en matraces T75, dos matraces por cerebro, y agregue un mililitro de homogenato cerebral a cada matraz. Incube las células hasta el aislamiento en el día dieciséis. Después de dieciséis días, transfiera el medio de crecimiento del matraz a un tubo nuevo de 50 mililitros.

Añada tres mililitros de tripsina-EDTA al 0,25 % a cada matraz T75. Luego agite los matraces durante cinco minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital. Centrifugue el medio de crecimiento a 0,4 veces g durante cinco minutos.

Después de agitar durante cinco minutos, agregue un mínimo de cuatro mililitros del medio de cultivo centrifugado para detener la reacción de tripsina-EDTA y triture para asegurar que todas las células se hayan desprendido. Luego pase las células a través de un filtro celular de 70 micrómetros para obtener un cultivo de células individuales. Realice un recuento celular y luego centrifugue a 0,4 veces g durante cinco minutos.

A continuación, tome un tubo de poliestireno de cinco mililitros, agregue un mililitro del medio recomendado y marque el menisco. Añada medio recomendado hasta 2,5 mililitros y marque también este menisco. Luego, retire el medio y vuelva a suspender el precipitado en 500 microlitros de medio recomendado.

Transfiera esta mezcla a un tubo de poliestireno de cinco mililitros y luego diluya hasta la marca de un mililitro. A continuación, añada 50 microlitros de suero de rata por cada mililitro de células en suspensión e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, prepare el cóctel de selección mezclando 25 microlitros del componente A y 25 microlitros del componente B. Una vez transcurridos los cinco minutos, añada 50 microlitros del cóctel de selección a las células e incube durante cinco minutos adicionales a temperatura ambiente.

Vortexee las microesferas durante 45 segundos. A continuación, añada 80 microlitros de microesferas por cada mililitro de muestra e incube durante tres minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue medio recomendado hasta la marca de 2,5 mililitros en el tubo de poliestireno.

Coloque el tubo en el soporte magnético durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, vierta lentamente el medio en un tubo de poliestireno de 15 mililitros que aún esté en el imán. Repita la separación magnética otras tres veces, agregando cada vez medio recomendado hasta la marca de 2,5 mililitros.

Después de la última separación magnética, agregue tres mililitros de medio de crecimiento y cuente el número de células utilizando un contador de células. Siembre las células en placas recubiertas con poli-D-lisina para los tratamientos. Siembre la fracción negativa del tubo de 15 mililitros, que contiene principalmente astrocitos, en matraces T75.

Después de al menos seis horas de incubación en un incubador a 37 grados Celsius, reemplace todo el medio de crecimiento en los frascos que contienen la fracción negativa antes de devolverlos al incubador. Esta imagen muestra la inmunocitoquímica de un cultivo aislado de microglía marcado para IBA, un marcador de microglía en el canal verde, y GFAP, un marcador de astrocitos, en el canal rojo. La tinción con Hoechst revela la presencia de núcleos celulares.

La ausencia de células positivas para GFAP demuestra que los microglías aislados mediante el kit de selección positiva para CD11b también presentan alta pureza. Las proteínas inmunodetectadas procedentes de un cultivo microglial aislado fueron analizadas para GFAP, que aparece como una banda de aproximadamente 51 kilodaltons, y para IBA1, que aparece como una banda de aproximadamente 15 kilodaltons. Se utilizó beta-actina como control de carga y aparece a aproximadamente 42 kilodaltons.

Un problema con el antiguo kit de aislamiento era que se podía observar fluorescencia de PE en el canal rojo, como se ve aquí. El procedimiento modificado no produce ninguna autofluorescencia de las perlas magnéticas, como se observa en el canal rojo aquí. Las microglías aisladas mediante este procedimiento pueden utilizarse para estudios de señalización.

El análisis por inmunotransferencia muestra que se pueden detectar Fyn y fosfo-src tirosina Y416 en microglía aislada mediante nuestro método recién refinado. La fracción negativa de la separación de microglía contiene astrocitos que pueden utilizarse para estudios de señalización. La inmunotransferencia muestra que la fracción negativa contiene células positivas para GFAP.

El análisis por inmunotransferencia muestra que Fyn y la tirosina fosforilada de Src en Y416 pueden detectarse en las células positivas para GFAP. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como microscopía de fluorescencia multicanal, inmunotransferencia y PCR cuantitativa, para responder preguntas relacionadas con la expresión génica y la señalización proteica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar esta técnica de aislamiento rápido con fines de experimentación con microglía.