Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

El objetivo general de este procedimiento es capturar la dinámica de la membrana mediante microscopía electrónica tras la inducción de la actividad neuronal usando optogenética, seguida del congelamiento de las células en puntos de tiempo definidos tras la estimulación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia y biología celular sobre los mecanismos de reciclaje de vesículas sinápticas y también, quizás, modelarlos a una escala de tiempo muy rápida. La principal ventaja de esta técnica consiste en poder visualizar cambios morfológicos dentro de una célula mediante microscopía electrónica a una escala de tiempo de milisegundos.

El procedimiento será demostrado por Shuo Li, una estudiante de posgrado, y Sumana Raychaudhuri, una asociada de investigación. Ambas del laboratorio de mi grupo. Antes de preparar el fijador, etiquete dos viales criogénicos de un mililitro con un lápiz según sus números de espécimen.

Luego combine todos los reactivos fijadores y alícuote un mililitro de volumen del fijador en cada vial. Después de tapar los tubos, sumerja inmediatamente los fijadores en nitrógeno líquido y almacene los viales en una caja de poliestireno cerrada. A continuación, llene una unidad automatizada de sustitución criogénica y un congelador de alta presión con nitrógeno líquido.

Luego, coloque un recipiente pequeño con acetona en la cámara de la muestra de la unidad de sustitución libre y espere hasta que la temperatura de la unidad de sustitución alcance menos 90 grados Celsius. Para programar el protocolo de estimulación luminosa, haga clic en editar en la ventana de estimulación luminosa del monitor táctil. Se abrirá otra ventana.

Ingrese 15 segundos para la fase oscura, 100 milisegundos para el período, 10 milisegundos para el pulso y uno para el número de períodos para un único estímulo de 10 milisegundos.

En la pantalla principal, confirme que la casilla de estimulación luminosa esté marcada y haga clic en almacenamiento de muestras seguido de editar. En la nueva ventana, utilice el botón más o menos para seleccionar dos y almacenar dos muestras en cada canal, y confirme que esté seleccionada la opción de nitrógeno líquido para almacenamiento. Ahora, bajo un microscopio estereoscópico, coloque un disco de zafiro con la cara celular hacia arriba en el pocillo de una placa negra media.

Seguido de un anillo espaciador de 100 micrones. Sumerja un lado de un disco de zafiro en blanco en una solución salina precalentada y coloque el disco sobre el anillo espaciador, con el lado de la salina hacia abajo. Coloque otro anillo espaciador de 100 micrones.

Y un anillo espaciador de 400 micrones encima del último disco de zafiro, y utilice papel de filtro para eliminar cualquier exceso de líquido. Mientras sostiene las muestras, asegúrese de no atrapar burbujas de aire entre los discos de zafiro. Luego, coloque el conjunto completo entre los dos cilindros semitransparentes y cierre la tapa roja superior para iniciar el proceso de congelación.

La tapa roja volverá a subir automáticamente una vez que el proceso de congelación haya finalizado. Cuando todas las muestras hayan sido congeladas, abra la puerta del depósito de almacenamiento y transfiera el depósito a la superficie de trabajo. Transfiera la cámara de especímenes del depósito de almacenamiento a una bandeja de muestra especializada llena de nitrógeno líquido.

Y desbloquee el botón para liberar el recipiente de la muestra. Luego, use un par de pinzas con puntas enfriadas con nitrógeno líquido para retirar los cilindros semitransparentes del recipiente de la muestra. Y transfiera cuidadosamente las placas negras centrales a un pequeño recipiente que contenga nitrógeno líquido.

Tenga cuidado de mantener las muestras congeladas bajo nitrógeno líquido en todo momento y de manipularlas siempre con pinzas previamente enfriadas. Enfríe nuevamente las pinzas y transfiera rápidamente la primera placa central al acetona previamente enfriado. Agite y golpee suavemente la placa para separar el disco de zafiro de la placa.

Luego, coloque un frasco criogénico abierto con fijador en una cámara de espécimen en la unidad de sustitución. Transfiera el disco de zafiro al vial. Y tape inmediatamente el vial.

Una vez que se hayan transferido todas las muestras, configure los parámetros adecuados del programa de sustitución libre e inicie el programa. Al finalizar el programa de sustitución libre, use guantes para transferir los viales criogénicos desde la cámara de muestras a una campana química y utilice una pipeta para agregar acetona a temperatura ambiente a cada vial. Reemplace la solución de lavado en cada vial con acetona fresca de cuatro a seis veces durante un período de una a dos horas.

Luego, agregue resina epoxi recién preparada al 30 % a cada vial para una incubación de dos a tres horas a temperatura ambiente en un agitador orbital a 120 rpm. Al final de la incubación, reemplace la resina epoxi al 30 % con resina epoxi al 70 % para una incubación de tres a cuatro horas en el agitador orbital. Luego, use pinzas para transferir cada disco, con la cara celular hacia arriba, a la tapa de una cápsula de inclusión y agregue resina epoxi al 90 % a los discos para una incubación nocturna a cuatro grados Celsius.

A la mañana siguiente, transfiera cada disco de zafiro a la tapa de una cápsula de inclusión nueva y llene la tapa con resina epoxi al 100% recién preparada. Después de la última incubación con resina epoxi al 100%, polimerice las muestras en un horno a 60 grados Celsius durante 48 horas. Cuando las muestras hayan polimerizado, coloque la primera muestra boca abajo sobre el microscopio estereoscópico de modo que el disco de zafiro quede en la parte superior del bloque de resina, y use una cuchilla de afeitar para eliminar una capa delgada de resina de la parte superior de la muestra.

A continuación, utilice la cuchilla de afeitar para cortar una línea superficial a lo largo del borde del disco y separar el disco de zafiro de la resina epoxi. Sumerja el disco en nitrógeno líquido durante unos 10 segundos para separar el disco del resto de la resina. Transfiera la resina bajo un microscopio estereoscópico y sujete la muestra a la platina del microscopio.

Utilizando un aumento de cuatro a 10X, localice un área con células y use una cuchilla de doble filo para cortar un área de dos por dos milímetros alrededor de la región de interés. Luego, use pegamento instantáneo para montar las células sobre un bloque cilíndrico falso hecho de resina epoxi e incube el bloque a 60 grados Celsius durante una hora. Después de seccionar en un ultramicrótomo, transfiera las muestras a un microscopio electrónico de transmisión para obtener imágenes con un aumento de 930.000X.

En esta imagen, se muestra la fusión de vesículas sinápticas mediante exocitosis registrada 15 milisegundos después del inicio de la luz dentro de la zona activa de una membrana presináptica en una neurona del hipocampo de ratón. 100 milisegundos después del inicio de la luz, puede observarse una fosa endocitótica adyacente a la zona activa, lo que ilustra la endocitosis ultrarrápida por parte de la célula nerviosa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo procesar muestras con experimentos de flash y congelación.

Recuerde que trabajar con glutaraldehído, tetraóxido de osmio y nitrógeno líquido puede ser realmente peligroso, por lo que asegúrese de usar ropa protectora. Una vez dominada, la parte de congelamiento de este procedimiento puede realizarse en un par de horas para 12 muestras, pero el resto del procedimiento, incluyendo la obtención de imágenes y el análisis de imágenes, puede tardar días, semanas o incluso meses, por lo que podría tratarse de un procedimiento muy largo. Si localiza proteínas o visualiza sus dinámicas, también puede utilizar diferentes protocolos para preservar la antigenicidad o la perlacidad de las proteínas perladas y visualizar sus dinámicas mediante estas técnicas.