Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos
21 de diciembre de 2017
Este manuscrito describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) con sonda de ADN marcada con fluorescencia, para el uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH es un método de visualización que permite la detección simultánea, localización y cuantificación de moléculas individuales de ARNm en células individuales fijas.
El objetivo general de este protocolo es etiquetar transcripciones individuales en E. Coli para sondas de ADN marcadas con fluorescencia para su visualización en experimentos de FiSH de una sola molécula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de sistemas, como la caracterización de las transcripciones de la capacidad célula a célula del campo de interés. Así como las transcripciones de la localización de la pared celular.
La principal ventaja de esta técnica es que proporciona cantidad de información sobre las estadísticas de los procesos transcripcionales. Para comenzar el protocolo, cultive E.Coli MG1655 en medio LB durante la noche en un agitador orbital, a 260 RPM y 37 grados Celsius. Al día siguiente, diluya el cultivo durante la noche a uno por 100 en medio fresco y mida su densidad óptica en un espectrofotómetro, hasta un valor de 0,2 a 0,4.
A continuación, granule las células por centrifugación durante cinco minutos a 4.500 G a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante de todos los tubos. Agregue un mililitro de 1XPBS a cada tubo y vuelva a suspender el pellet para minimizar la agregación de célula a célula.
A continuación, añada cuatro mililitros de tampón de fijación y agite suavemente el tubo. Incubar las muestras en un agitador orbital. Vuelva a suspender el gránulo para minimizar la agregación de célula a célula, que puede interferir con la obtención de imágenes celulares.
Después de la incubación, granule las células, retire el sobrenadante y agregue un mililitro de 1XPBS. Transfiera las suspensiones a tubos de microcentrífuga de fondo cónico de 1,8 mililitros. Granular las células por centrifugación.
Comience la permeabilización de las bacterias eliminando cuidadosamente el sobrenadante. Utilice pipetas de pequeño volumen para eliminar todo el líquido fuera del pellet. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 300 microlitros de agua tratada con DEPC.
Agregue 350 microlitros de etanol absoluto de alta calidad y mezcle la solución suavemente invirtiendo el tubo. Agregue otros 350 microlitros de etanol y mezcle nuevamente. A continuación, gire la muestra con el rotador de tubos a 20 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
Pellet las células de la permeabilización. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante. Agregue un mililitro de tampón de lavado al 20% a las muestras.
Déjalos reposar durante varios minutos. A continuación, las células de pellets por centrifugación durante siete minutos a 750 G y cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante con mucha suavidad y utilice pipetas de pequeño volumen para eliminar todo el líquido del exterior del pellet.
A continuación, añada la solución madre del conjunto de sondas de oligonucleótidos a la alícuota del tampón de hibridación de modo que la concentración final de oligonucleótidos sea de 250 nanomolares y vórdese el tubo vigorosamente. Suspender las muestras en 50 microlitros de tampón de hibridación que contiene las sondas de oligonucleótidos, evitando la generación de burbujas. Deje las muestras toda la noche, en la oscuridad, en un bloque de calor a 30 grados centígrados.
Para preparar el lavado, obtenga un nuevo tubo de microcentrífuga para cada muestra que se va a fotografiar. Agregue un mililitro de tampón de lavado a cada tubo. Agregue de 10 a 15 microlitros de las muestras hibridadas al nuevo tubo que contiene el tampón de lavado.
Granular las células por centrifugación. A continuación, retira el sobrenadante. Lave las muestras dos veces más.
Vuelva a suspender el pellet en tampón de lavado de 25 microlitros. Prepare un gel de agarosa agregando 150 miligramos de agarosa a 10 mililitros de tampón SSC 2X. Calienta la solución en el microondas durante 10 a 15 segundos cada vez, hasta que la agarosa se disuelva por completo.
A continuación, deja el tubo a un lado para que se enfríe durante unos minutos. A continuación, coloque un marco de silicona separador en el portaobjetos para que el centro del portaobjetos permanezca expuesto. Coloque un anillo rígido de 10 milímetros de ancho y de uno a dos milímetros de grosor en el centro del portaobjetos.
Deposite una pequeña cantidad de gel en el centro para sellar y espere unos minutos para que el gel se endurezca. Luego agregue más gel, hasta que se forme una forma de cúpula alta. Espere unos 10 minutos para que el gel se endurezca y retire el anillo.
Deposite 10 microlitros de células bacterianas de lavado en el gel y séllelo con un portaobjetos de cubierta número cero. Mantenga la muestra en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo. Las mediciones de smFiSH de células de E. coli muestran el nivel de inducción de galK en respuesta a concentraciones variables de D-fucosa extracelular.
La señal de fondo se muestra mediante una deformación galK eliminada o delta galK JW0740 como control negativo. Se observan numerosas manchas en la mayoría de las células. Corresponde a transcripciones de una o pocas galK cuando se añaden dos milimolares de D-fucosa al cultivo bacteriano.
Mientras que se observan algunas manchas en ausencia de D-fucosa extracelular. Otro ejemplo para la aplicación de este protocolo es el gen sodB, con imágenes de fluorescencia y contraste de fase de smFiSH en un tipo salvaje o una cepa delecionada con sodB JW1648. Las muestras preparadas con este protocolo también pueden ser visualizadas utilizando STORM, que permite una precisión precisa de las transcripciones en la célula.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de sistemas exploraran las estadísticas de los eventos de transcripción en células individuales.
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Resumen
Este manuscrito describe un método para marcar transcritos individuales de ARN mensajero (ARNm) con sondas de ADN marcadas con fluoróforos, para su uso en experimentos de hibridación in situ por fluorescencia a nivel de molécula individual (smFISH) en E. coli. Esta técnica permite la detección, localización y cuantificación simultáneas de moléculas individuales de ARNm en células individuales fijadas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología de Sistemas
- Biología Celular
Antecedentes
- La hibridación fluorescente in situ en una sola molécula (smFISH) es un método de visualización potente.
- Este método permite el estudio de los procesos transcripcionales a nivel de célula individual.
- Comprender la localización y cuantificación del ARNm es fundamental para la biología de sistemas.
- E. coli sirve como organismo modelo para estos experimentos.
Objetivo del estudio
- Etiquetar transcritos individuales de ARNm en E. coli.
- Visualizar la localización de ARNm utilizando sondas de ADN marcadas con fluorescencia.
- Mejorar la comprensión de la variabilidad transcripcional entre células.
Métodos Utilizados
- Cultivar E. coli MG1655 en medio LB durante la noche.
- Diluir el cultivo nocturno en medio fresco.
- Medir la densidad óptica para asegurar condiciones adecuadas de crecimiento.
- Aplicar sondas de ADN marcadas con fluorescencia para el análisis de smFISH.
Resultados principales
- Etiquetado exitoso de transcritos individuales de ARNm.
- Visualización de la localización de ARNm dentro de células fijadas.
- Cuantificación de procesos transcripcionales a nivel de molécula individual.
- Información sobre la variabilidad entre células en la expresión de transcritos.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque robusto para estudiar la dinámica del ARNm.
- Contribuye con información valiosa al campo de la biología de sistemas.
- Esta técnica puede aplicarse a diversas preguntas de investigación relacionadas con la expresión génica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
hibridación fluorescente in situ de molécula individual (smFISH) en E. coli permite la cuantificación directa y la cartografía espacial de transcritos de ARNm con resolución a nivel de célula individual, abordando desafíos clave en la comprensión de la heterogeneidad transcripcional. Esta capacidad respalda la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al revelar la variabilidad entre células y la localización subcelular de los transcritos. El método está estratégicamente posicionado para la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en los flujos de trabajo de biología de sistemas microbianos y biología sintética.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación cuantitativa de la variabilidad en la expresión génica entre células bacterianas individuales.
- Apoya la desestimación mecanicista al mapear la localización y abundancia de transcritos con resolución de molécula individual.
- Facilita la validación funcional de objetivos al distinguir efectos biológicos reales de artefactos promediados en la población.
- Proporciona datos de alto contenido para el análisis de vías guiado por hipótesis en modelos microbianos.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Prepara sistemas bacterianos validados para el cribado posterior de la regulación génica o de construcciones sintéticas.
- Proporciona resultados cuantitativos reproducibles del número de copias de ARNm para la estandarización de ensayos.
- Permite la detección multiplex de transcritos dentro de una sola célula, limitada por la superposición espectral de los fluoróforos.
- Facilita la evaluación robusta de la inducción o represión génica en respuesta a perturbaciones experimentales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con las estrategias traslacionales de biomarcadores al permitir la cuantificación precisa de los cambios en la expresión génica en modelos microbianos.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de cepas modificadas o intervenciones en vías metabólicas.
- Reduce el riesgo al avanzar en dianas microbianas al suministrar datos con resolución a nivel de célula individual sobre la dinámica transcripcional.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de etiquetado smFISH se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico para sistemas microbianos, apoyando tanto la comprobación de hipótesis como el análisis cuantitativo.
- Biología del Descubrimiento: Proporciona la medición directa de eventos transcripcionales y la distribución espacial de transcritos para aclarar rutas biológicas.
- Selección: Ofrece lecturas cuantitativas estandarizadas para evaluar la modulación de la expresión génica en cepas modificadas o silvestres.
- Análisis: Permite el análisis estadístico de las distribuciones del número de copias de ARNm y la variabilidad entre células mediante software de código abierto o personalizado.
- Investigación Traslacional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con modelos preclínicos mediante la validación de cambios en la expresión génica a resolución individual de células.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo reutilizable para la cuantificación de transcritos en diversos sistemas bacterianos y contextos experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de expresión génica microbiana.
- Valor operativo: Estandariza la etiquetación de transcritos y la obtención de imágenes para generar datos reproducibles y escalables.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción de objetivos microbianos y constructos sintéticos al proporcionar datos de expresión de alta resolución.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos microbianos y vías modificadas basándose en análisis cuantitativos a nivel de célula individual.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de células bacterianas, fijación y microscopía de fluorescencia.
- Necesita acceso a plataformas de imagen de fluorescencia con detección de baja intensidad y conjuntos de filtros adecuados.
- Exige la estandarización entre equipos en el diseño de sondas y los protocolos de imagen para lograr reproducibilidad.
- La adaptación a otras cepas bacterianas u objetivos génicos puede requerir el rediseño de sondas y la optimización espectral.
- La multiplexación está limitada por la superposición espectral de los fluoróforos disponibles, lo que restringe la detección simultánea de genes.
