Un análisis Simple y de bajo costo para la medición de actividad en modelos de ratón de la Distrofia Muscular
29 de diciembre de 2017
Este protocolo describe un sistema flexible y de bajo costo para la medición de ambulación de ratón en un ensayo de actividad de campo abierto. Mostramos que un paseo de 6 minutos el análisis basado en este sistema detecta una disminución del movimiento voluntario en ratones mdx y distingue con precisión mejora en un rescate de músculo-específica de estos animales.
El objetivo general de este ensayo es medir la ambulación voluntaria en modelos murinos de distrofia muscular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la distrofia muscular sobre la progresión de la debilidad muscular en modelos murinos de distrofia muscular, y la eficacia de posibles terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una medición no invasiva y reproducible de la actividad animal que puede adaptarse fácilmente a muchos entornos de investigación diferentes.
En una habitación tranquila con temperatura controlada y a una hora constante del día, coloque una cámara sobre una malla metálica por encima de la cámara de actividad para permitir la grabación en toda el área y limpie la cámara con desinfectante. Inmediatamente antes de la grabación de la actividad, permita que el ratón agarre la barra del dinamómetro digital y tire suavemente hacia atrás hasta que se suelte la barra. Registre la tensión máxima en newtons para cada ensayo.
Con un minuto de descanso entre cada ensayo. Inmediatamente después del ensayo de fuerza de agarre, coloque al ratón en la cámara y comience la grabación de video, permitiendo que el ratón explore libremente. Después de seis minutos, detenga la grabación y devuelva al ratón a su jaula de alojamiento.
Para el análisis de seguimiento de los datos de video, primero abra la grabación en el software de edición de video adecuado y configure la velocidad al doble. Exporte el video reducido en formato de archivo mp4 para el análisis de seguimiento y abra el video en el programa de análisis de video apropiado. Para establecer la calibración de la grabación de video, utilice la herramienta de línea para dibujar una línea a lo largo de un lado de la cámara.
Haga clic derecho sobre la línea, seleccione calibrar medida e introduzca el tamaño real del lado de la cámara en centímetros. Para comenzar el seguimiento semiautomático de la posición del ratón, haga clic en el cursor de movimiento. Comenzando en el fotograma inicial del video, haga clic derecho sobre el punto que se desea rastrear.
El punto de seguimiento se marcará con un círculo azul. Utilice la flecha derecha del teclado para avanzar el fotograma. El punto de seguimiento debería moverse automáticamente según la posición de la base de la cola.
Si la posición de seguimiento no está alineada con el punto de interés en un fotograma determinado, alinee manualmente el círculo azul con la posición de seguimiento. Cuando se haya realizado el seguimiento de todo el video, guarde el video y la superposición del trazado y seleccione exportar a hoja de cálculo para exportar los datos posicionales del trazado. En consonancia con los resultados informados en ensayos similares, los ratones mdx nulos para distrofina sometidos a un protocolo de ejercicio inmediatamente antes de la prueba muestran una actividad voluntaria significativamente menor en una prueba de campo abierto de seis minutos, en comparación con los animales de tipo silvestre.
De hecho, tras el esfuerzo leve de una prueba de fuerza de agarre, los ratones mdx normalmente permanecieron inmóviles durante los primeros minutos del protocolo de deambulación, con un aumento moderado en el movimiento entre los minutos cuatro y cinco. Sin embargo, al comparar animales de tipo salvaje y mdx sin un desafío de ejercicio, no se detectan diferencias en la distancia recorrida. Los ratones mdx transgénicos para la expresión de utrofina son indistinguibles de los animales de tipo salvaje, sin diferencias significativas en la distancia total recorrida ni en ninguno de los puntos temporales acumulativos observados.
Para determinar el efecto de reducir la frecuencia de muestreo, se midió la distancia total recorrida en un minuto de video a frecuencia máxima de cuadros y se comparó con las mediciones de distancia obtenidas a partir de versiones submuestreadas del conjunto de datos. Reducir la frecuencia de cuadros a la mitad disminuyó la distancia medida en un 5 % con respecto a la distancia original calculada. La precisión de la distancia medida disminuye bruscamente después de este punto, aunque incluso conjuntos de datos altamente decimados aún aproximan de forma cercana la trayectoria del animal, lo que resalta la importancia de considerar la frecuencia de cuadros y el procesamiento de la señal al evaluar la actividad animal, y demuestra que se puede mantener una alta resolución espacial en datos de video submuestreados.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar y analizar la ambulación de ratones en un entorno de campo abierto. Una vez dominado, este análisis puede completarse en 15 a 30 minutos si se realiza adecuadamente. Este ensayo de bajo costo y no invasivo permite a los investigadores examinar la actividad motora en modelos de ratón de distrofia muscular, y puede servir como un primer paso informativo para mediciones funcionales adicionales.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este protocolo describe un sistema flexible y de bajo costo para medir la deambulación de ratones en un ensayo de actividad en campo abierto. El método proporciona una medición no invasiva y reproducible de la actividad animal, que puede adaptarse a diversos entornos de investigación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Investigación sobre distrofia muscular
- Análisis conductual
Antecedentes
- El ensayo mide la ambulación voluntaria en modelos murinos de distrofia muscular.
- Aborda preguntas clave sobre la progresión de la debilidad muscular.
- La técnica está diseñada para evaluar la eficacia de posibles terapéuticos.
- La grabación se realiza en un entorno controlado para garantizar la consistencia.
Objetivo del estudio
- Medir el movimiento voluntario en ratones mdx.
- Evaluar el impacto de intervenciones específicas en el músculo.
- Proporcionar información sobre la progresión de la distrofia muscular.
Métodos Utilizados
- Uso de una cámara colocada encima de la cámara de actividad para la grabación.
- Limpieza de la cámara con desinfectante antes de los ensayos.
- Permitir que el ratón agarre una barra vertical para medir la tensión máxima.
- Registro de la actividad durante un ensayo de ambulación de 6 minutos.
Resultados principales
- El sistema detecta disminuciones en el movimiento voluntario en ratones mdx.
- Distingue con precisión las mejoras debidas al rescate específico del músculo.
- Los resultados son reproducibles entre diferentes ensayos.
- El método es adaptable a diversos entornos de investigación.
Conclusiones
- Este ensayo es eficaz para estudiar la distrofia muscular en ratones.
- Proporciona datos valiosos sobre la eficacia de tratamientos potenciales.
- El enfoque es flexible y puede utilizarse en diversos entornos de investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición de la ambulación voluntaria en modelos murinos proporciona una lectura traslacional de la función motora en la distrofia muscular, análoga directamente a puntos finales clínicos como la prueba de caminata de 6 minutos. Este ensayo basado en video y de bajo costo permite evaluar de forma reproducible y no invasiva la progresión de la enfermedad y la respuesta terapéutica en estudios preclínicos. Al detectar déficits de actividad en ratones mdx deficientes en distrofina y su recuperación mediante la expresión de utrofina, este método apoya la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en el descubrimiento de fármacos para enfermedades neuromusculares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de la deambulación voluntaria como lectura funcional de la fuerza muscular en modelos distroficos.
- Valor operativo: Permite la desestimación biológica mediante la correlación reproducible entre genotipo y fenotipo en ratones mdx frente a cohortes salvajes y rescatadas.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al distinguir intervenciones efectivas (por ejemplo, transgén de utrofina) que normalizan los niveles de actividad hasta los valores del tipo salvaje.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la cribado de compuestos posteriores utilizando métricas estandarizadas de ambulación en campo abierto.
- Reproducibilidad: Proporciona resultados cuantitativos basados en distancia y tiempo, adecuados para la estandarización del ensayo entre diferentes laboratorios.
- Escalabilidad: Aprovecha software de código abierto gratuito y hardware accesible para permitir la reutilización de la plataforma en diversos entornos de investigación sin necesidad de equipo especializado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela déficits de deambulación relevantes para el paciente, proporcionando una continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Aclara si los efectos observados se deben a una recuperación específica del músculo o a cambios inespecíficos en la actividad.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Orienta los criterios de continuar/no continuar mediante la correlación entre la recuperación de la deambulación y el acoplamiento al objetivo y la modulación de la vía.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, ofreciendo un puente funcional entre los mecanismos moleculares y los resultados fenotípicos en modelos de distrofia muscular.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al vincular intervenciones genéticas o farmacológicas con cambios medibles en el movimiento voluntario.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante un seguimiento reproducible basado en video que genera puntos finales cuantificables de deambulación para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Genera flujos de datos posicionales y temporales que permiten a los equipos comparar la actividad locomotora entre genotipos, tratamientos y puntos temporales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al replicar evaluaciones clínicas de deambulación, facilitando la alineación de biomarcadores y la modelización predictiva.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable y de bajo costo para pruebas de deambulación que reduce la dependencia de instalaciones centrales especializadas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en los ensayos de función motora.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y reproducibilidad mediante el seguimiento de código abierto y condiciones ambientales controladas.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al eliminar la necesidad de sistemas costosos de seguimiento de movimiento, manteniendo la calidad de los datos.
- Impacto en la cartera: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en la recuperación funcional de los fenotipos de deambulación en modelos preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere conocimientos básicos en grabación de video y software de seguimiento de código abierto (por ejemplo, alineación manual cuadro por cuadro).
- Depende de equipos de imagen estándar y controles ambientales consistentes (iluminación, temperatura, hora del día).
- Necesita el cumplimiento de protocolos entre equipos para garantizar la reproducibilidad entre sitios y operadores.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tamaños de cámara, cepas de ratón y niveles de actividad.
- Supone compromisos entre la frecuencia de fotogramas y la precisión de la medición, ya que la reducción de muestreo disminuye la precisión en el cálculo de la distancia.
