Aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil
25 de enero de 2018
Este protocolo describe el uso del modelo de actividad contráctil crónica de ejercicio observar adaptaciones del músculo esquelético inducida por el estímulo en la trasera de la rata.
El modelo de actividad contráctil crónica del ejercicio es útil para estudiar in vivo las adaptaciones del músculo esquelético a los estímulos del entrenamiento del ejercicio. En particular, este modelo provoca las adaptaciones fenotípicas de un protocolo de entrenamiento de seis semanas en siete días. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología muscular, como la biogénesis mitocondrial, la autofagia y muchas otras adaptaciones celulares asociadas al ejercicio.
La principal ventaja de esta técnica es que permite observar las adaptaciones específicas de los músculos en un corto período de tiempo de siete días en comparación con otros protocolos de entrenamiento con ejercicios que requieren varios meses. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la atrofia muscular porque se ha demostrado que la estimulación muscular crónica tiene un efecto en la mejora de la debilidad muscular relacionada con el envejecimiento. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la dificultad para marcar el nervio peroneo común y colocar bobinas eléctricas en ambos extremos, ya que requieren práctica y precisión.
Comience por anestesiar a la rata bajo una inhalación de 1 a 3% de isoflurano con oxígeno y confirme la sedación completa verificando la respuesta a un pellizco de la extremidad trasera y observando la profundidad y la frecuencia respiratoria. Aplique lubricante ocular en los ojos para evitar la sequedad y coloque a la rata en una almohadilla térmica a una temperatura baja a media. Afeita suavemente la extremidad trasera izquierda, así como una tira alrededor del torso desde la parte posterior del cuello, alrededor de detrás de las extremidades anteriores y a través del tórax anterior.
Limpie suavemente las áreas afeitadas con yodo y alcohol etílico para desinfectar. Con el animal acostado boca abajo, use un bisturí estéril con una hoja número 10 para hacer una pequeña incisión de alrededor de 0,5 centímetros en la parte posterior del cuello en el centro de la región afeitada. Luego enrolle el animal sobre su lado derecho y haga un corte de dos a tres centímetros en la piel de la extremidad trasera izquierda entre el hoyuelo de la articulación de la rodilla y cerca del origen de la cola.
Con unas tijeras quirúrgicas curvas de punta roma, diseccione el área subcutánea hasta unos 3,5 a cuatro centímetros, separando la piel del músculo subyacente para hacer un bolsillo entre la piel abierta y el músculo subyacente. A continuación, utilice unas tijeras quirúrgicas para hacer una pequeña incisión de menos de 0,5 centímetros en el músculo bíceps femoral, asegurándose de que las puntas de las tijeras corten directamente a través del músculo. A continuación, abra suavemente la zona de corte hasta que los grupos musculares internos y el nervio peroneo común sean visibles.
Tenga mucho cuidado para evitar cortar o dañar el nervio. A continuación, prepare de 50 a 60 centímetros de alambre fino de acero inoxidable recubierto de PTFE y dóblelo por la mitad. Enganche la parte doblada del cable en la ranura de una varilla de acero inoxidable de 30 centímetros.
Use la varilla para pasar el alambre a través del bolsillo abierto de la extremidad trasera, subiendo por la pierna y a lo largo del centro de la espalda en un patrón en forma de L para llegar a la pequeña área de incisión en la parte posterior del cuello. Arregle la ventana tirando de ella para abrirla con retractores de metal hasta que el tamaño de la ventana sea de aproximadamente 1,5 centímetros cuadrados con el nervio peroneo en el centro de la ventana. Con un bisturí, pele con cuidado los extremos del alambre 1,5 centímetros.
Envuelve los extremos del alambre pelado alrededor de una aguja desafilada de calibre 21 cinco veces para hacer una bobina. Una vez que las bobinas estén hechas correctamente, suelte la aguja de ellas. Haga un nudo en el extremo de la bobina y suérela en el lado izquierdo del nervio, asegurándose de que la bobina esté a 1,5 a 2,5 milímetros del nervio.
Para asegurar la bobina, aplique dos o tres suturas adicionales a lo largo de la bobina. Este paso requiere mucha práctica y paciencia para evitar dañar el nervio y el músculo subyacente y lograr todas las condiciones de estimulación consistentes en todos los animales. Lo mejor es contar con un investigador capacitado para completar todos los procedimientos quirúrgicos durante un estudio.
Aplique dos o tres gotas de solución antibiótica y luego suture cuidadosamente la ventana con seda tamaño 5-0. Enrolle sin apretar la cuerda floja restante del alambre y empújela en el bolsillo subcutáneo por encima de la incisión suturada del músculo bíceps femoral por encima de la cadera. Aplique dos o tres gotas de solución antibiótica y cierre la piel abierta con grapas.
A continuación, mueva al animal a la posición esternal y corte el lazo de alambre que sale de la incisión en la parte superior del cuello para crear dos extremos de alambre. Con un bisturí, pela los extremos de los alambres 0,5 centímetros. Corta los cables deshilachados.
Empuje lentamente las partes peladas de los cables en el orificio de los zócalos de las clavijas y, con un soldador, suelde los cables en los zócalos de las clavijas. Pase los extremos del cable conectado con clavijas a través de una gasa estéril de 4,4 centímetros. Luego pase los cables a través del orificio en la base de la caja del estimulador.
Inserte las clavijas en los zócalos de conexión de la unidad CCA. Coloque suavemente la unidad CCA en la cámara con una tachuela adhesiva para asegurar la unidad CCA en la parte inferior de la cámara. Use cinta adhesiva o cinta quirúrgica porosa para fijar la cámara alrededor del torso afeitado.
Cierre la parte superior de la cámara con tres capas de cinta adhesiva. Y termine envolviendo con cinta adhesiva los lados de la caja del estimulador para asegurar la caja. Compruebe si el CCA está funcionando exponiendo la unidad a un solo pulso de luz infrarroja emitida por una luz estroboscópica infrarroja portátil.
Si el CCA funciona correctamente, los músculos de las extremidades traseras se contraerán en respuesta a la luz infrarroja. Pese a los animales poco antes de comenzar el procedimiento de CCA para registrar una medición de referencia que ayude a identificar cualquier estrés severo o efectos adversos por el cambio de peso corporal después del procedimiento de CCA. El día de la estimulación CCA, encienda el CCA exponiendo la unidad estimuladora a un solo pulso de luz infrarroja mediante una luz estroboscópica infrarroja portátil y aplique tres o seis horas de estimulación CCA de 10 hercios.
Revise la estimulación y el animal cada 30 a 60 minutos. Después del período CCA deseado, apague la unidad CCA mediante la exposición a la luz infrarroja. Las ratas sometidas a siete días de CCA durante seis horas al día muestran una biogénesis mitocondrial mejorada en el músculo estimulado en comparación con la extremidad posterior contralateral no estimulada.
Este aumento en la biogénesis mitocondrial está indicado por el aumento de la expresión proteica de PGC-1 alfa. El examen de las fibras musculares permeabilizadas para medir la capacidad respiratoria mitocondrial revela que la ACC resultó en un aumento en la capacidad respiratoria máxima del músculo en relación con el músculo control. Tanto las poblaciones mitocondriales subsarcolemales como las intermiofibrilares aumentaron después de siete días de CCA en comparación con el músculo control no estimulado.
Las adaptaciones a los sistemas de autofagia y lisosomal también pueden ser provocadas por la CCA. Se observa un aumento en la abundancia de proteínas del factor de transcripción EB, el principal regulador de la biogénesis lisosomal, después de la CCA en todos los puntos temporales. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como inyecciones subcutáneas o intraperitoneales generales, para responder a preguntas adicionales, como la estimación del flujo de autofagia con el tratamiento con colchicina.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar el modelo actual de actividad contráctil crónica para examinar los cambios fenotípicos musculares después del entrenamiento de resistencia.
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Descripción general
Este protocolo describe el uso del modelo de actividad contráctil crónica del ejercicio para observar las adaptaciones del músculo esquelético inducidas por estimulación en la pata trasera de la rata. Este modelo permite a los investigadores estudiar las adaptaciones fenotípicas del músculo esquelético en un período corto de tiempo, proporcionando información sobre la fisiología muscular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Fisiología muscular
- Ciencia del ejercicio
- Adaptaciones al entrenamiento
Antecedentes
- El modelo de actividad contráctil crónica es eficaz para estudios in vivo.
- Este modelo puede revelar adaptaciones en un breve período de siete días.
- Aborda preguntas clave sobre la biogénesis mitocondrial y la autofagia.
- La estimulación muscular crónica podría ayudar a mitigar la debilidad muscular relacionada con el envejecimiento.
Objetivo del estudio
- Observar las adaptaciones del músculo esquelético a los estímulos del entrenamiento físico.
- Investigar los efectos de un protocolo de entrenamiento de seis semanas en un período de tiempo reducido.
- Mejorar la comprensión de las adaptaciones celulares asociadas con el ejercicio.
Métodos Utilizados
- Modelo de actividad contráctil crónica para la estimulación muscular.
- Observación de adaptaciones específicas del músculo.
- Técnicas de estimulación eléctrica que implican el nervio peroneo común.
- Evaluación de las respuestas mitocondriales y de autofagia.
Resultados principales
- Adaptaciones significativas del músculo esquelético observadas dentro de los siete días.
- Biogénesis mitocondrial mejorada observada en respuesta a la estimulación.
- Evidencia de cambios celulares relacionados con la autofagia.
- Implicaciones terapéuticas potenciales para la atrofia muscular en el envejecimiento.
Conclusiones
- El modelo de actividad contráctil crónica es una herramienta valiosa para estudiar las adaptaciones musculares.
- Las observaciones a corto plazo pueden proporcionar información significativa sobre la fisiología muscular.
- Investigaciones futuras podrían explorar aplicaciones terapéuticas para la debilidad muscular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El modelo de actividad contráctil crónica permite una evaluación rápida de las adaptaciones fenotípicas del músculo esquelético, proporcionando un período de tiempo acortado para evaluar los cambios moleculares inducidos por el ejercicio. Este enfoque apoya la validación de objetivos en fisiología muscular al aislar los efectos específicos de la contracción de los factores de confusión sistémicos, mejorando la confianza predictiva en estudios preclínicos de vías relacionadas con el metabolismo y la atrofia. La utilidad del modelo en el estudio de la biogénesis mitocondrial y la autofagia lo posiciona como una herramienta mecanicista para reducir riesgos en programas de descubrimiento temprano centrados en la salud muscular y el envejecimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la inducción de adaptaciones específicas del músculo independientes de factores humorales o neurológicos.
- Valor operativo: Logra cambios fenotípicos que normalmente requieren seis semanas de entrenamiento en solo siete días, acelerando los estudios de interacción con el blanco.
- Valor traslacional: Facilita la validación funcional de blancos implicados en las vías de biogénesis mitocondrial y autofagia, relevantes para enfermedades metabólicas y la sarcopenia.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Genera sistemas biológicos cuantificables con capacidad respiratoria mitocondrial mejorada y expresión de PGC-1α para cribado posterior de compuestos.
- Reproducibilidad: Parámetros estandarizados de estimulación (10 Hz, 3–6 horas/día) permiten la inducción consistente de adaptaciones mitocondriales subsarcolemales e intermiofibrilares.
- Escalabilidad: La implantación quirúrgica de bobinas de estimulación crónica permite el monitoreo longitudinal y el muestreo repetido de tejidos a lo largo de los grupos de estudio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Modela adaptaciones al entrenamiento de resistencia aplicables a la evaluación preclínica de intervenciones para la atrofia muscular y la debilidad relacionada con el envejecimiento.
- Reducción mecanicista de riesgos: Permite la evaluación del flujo de autofagia y la biogénesis lisosomal mediante la regulación positiva de TFEB, apoyando estudios de modulación de dianas.
- Confianza predictiva: Relaciona protocolos de estimulación aguda con fenotipos adaptativos crónicos, mejorando la traducción de candidatos que imitan el ejercicio.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta las pruebas de eficacia preclínica, especialmente para programas que investigan compuestos miméticos del ejercicio o reguladores específicos del músculo.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre vías de señalización inducidas por contracción al aislar las respuestas musculares directas a la estimulación crónica.
- Selección: Produce tejido muscular estandarizado y estimulado, adecuado para ensayos ex vivo que miden la capacidad respiratoria y los marcadores proteicos de adaptación.
- Análisis: Permite la evaluación cuantitativa de la biogénesis mitocondrial (mediante PGC-1α) y la autofagia (mediante TFEB) como indicadores farmacodinámicos.
- Investigación Traducional: Conecta las respuestas a la estimulación aguda con estados adaptativos crónicos, apoyando la modelización de la relación dosis-respuesta en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma quirúrgica y de estimulación reutilizable para la prueba iterativa de múltiples compuestos o manipulaciones genéticas en diversos estudios.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al distinguir las adaptaciones musculares autónomas de las células de los efectos sistémicos del ejercicio.
- Valor operativo: Proporciona una inducción reproducible y eficiente en el tiempo de adaptaciones mitocondriales y lisosomales, minimizando el uso de animales y la duración del estudio.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al ofrecer datos fenotípicos tempranos y específicos de la contracción antes de invertir en estudios de eficacia a largo plazo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos que actúan sobre vías metabólicas musculares mediante la validación rápida de la modulación del objetivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía de roedores, particularmente para la identificación precisa y manipulación del nervio peroneo común.
- Depende de instrumentación especializada que incluye unidades estimuladoras, sistemas de activación por infrarrojos e interfaces de electrodos con alambres soldados.
- Necesita una estandarización entre equipos de los protocolos quirúrgicos, parámetros de estimulación y momentos de recolección de tejidos para garantizar la consistencia entre animales.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar el modelo a diferentes grupos musculares o especies, debido a la variabilidad en la accesibilidad del nervio y la colocación de la bobina.
- Limitado por la curva técnica de aprendizaje asociada a la sutura de la bobina y la colocación del electrodo próximo al nervio, lo que exige una habilidad constante del operador para mantener la fidelidad de la estimulación.
