Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química

El objetivo general de la funcionalización química de la superficie de nanopartículas de HEV es proporcionar un enfoque repetible y consistente para la conjugación de moléculas inmunogénicas, terapéuticas y de diagnóstico dirigidas a la superficie de nanopartículas de HEV con fines de diagnóstico y tratamiento.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nanomedicina, como cómo se puede monitorear la mejora del direccionamiento al cáncer y la distribución de nano terapéuticos. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente reproducible, eficiente y mucho más sencilla de lograr en comparación con la generación de ingeniería genética.

Las demostraciones de los procedimientos estarán a cargo de Michelle Nguyen e Ivan Ruiz, ayudantes de investigación de nuestro laboratorio.

Comience este protocolo con la producción y purificación de nanopartículas del virus de la hepatitis E, tal como se describe en el protocolo escrito.

Diluya las muestras de nanopartículas de HEV entre 0,5 y dos miligramos por mililitro con MES 10 milimolar, pH 6,2 para un análisis por microscopía electrónica de transmisión. Ione las rejillas recubiertas con carbono mediante una descarga de corona de 40 miliamperios durante 30 segundos para producir una superficie de carbono hidrofílica. La superficie de carbono hidrofílica de las rejillas solo puede mantenerse durante 30 minutos tras el tratamiento con descarga de corona. Tras la ionización, sostenga la rejilla y las pinzas y añada dos microlitros de la muestra de nanopartículas de HEV sobre la rejilla.

Después de 15 a 30 segundos, retire el exceso de líquido de la rejilla con papel de filtro. Luego, lave inmediatamente la rejilla con agua doblemente destilada y vuelva a secar con papel de filtro. Añada inmediatamente dos microlitros de acetato de uranilo al dos por ciento a la rejilla. Después de 15 segundos, retire el exceso con papel de filtro. Seque las rejillas de muestra colocándolas en un gabinete desecador electrónico durante toda la noche.

Dependiendo de la muestra, puede ser necesario utilizar microscopía electrónica criogénica o criomicroscopía electrónica para la visualización y caracterización de la estructura. Transfiera la rejilla a un MET e imagine con un aumento de 10 a 80K. Las nanopartículas del VHE aparecen en el MET como proteínas icosaédricas vacías de aproximadamente 27 nanómetros de diámetro debido a la ausencia de ARN viral.

Para realizar la conjugación en un solo paso de nanopartículas de HEV y biotina vinculada a maleimida, primero aplique las nanopartículas de HEV a unidades de diálisis miniatura. Diализe las nanopartículas frente a PBS 0,01 molar, pH 7,4, a temperatura ambiente durante una hora según el protocolo del fabricante. Tras la diálisis, transfiera las nanopartículas de HEV a tubos de 1,5 mililitros y mida la concentración de proteína a 280 nanómetros utilizando un espectrofotómetro. Mezcle las nanopartículas a una concentración de un miligramo por mililitro con una cantidad igual de biotina-maleimida 100 micromolar y PBS 0,01 molar, pH 7,4, para obtener una relación molar de uno a cinco. Después de reaccionar durante la noche a cuatro grados Celsius, elimine la biotina-maleimida no unida mediante un procedimiento con columna de desalación por centrifugación según el protocolo del fabricante. Analice las muestras mediante una electroforesis SDS convencional en condiciones reductoras.

Utilizando los procedimientos estándar, prepare un inmunotransferencia Western quimioluminiscente usando estreptavidina conjugada con HRP y capture la señal quimioluminiscente mediante película de rayos X.

Para realizar la conjugación en dos pasos del ligando específico para células de cáncer de mama, LXY30, a la cisteína expuesta en la superficie de nanopartículas de HEV, primero aplique las nanopartículas a unidades de diálisis miniatura y dialice frente a PBS 0,01 molar, pH 7,4, a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, transfiera las nanopartículas de HEV a tubos de 1,5 mililitros y mida la concentración de proteína a 280 nanómetros utilizando un espectrofotómetro. Luego, combine 650 micromolar de maleimida-azida y 650 micromolar de alquino-LXY30 con 200 micromolar de sulfato de cobre y un milimolar de ácido ascórbico. Esto forma LXY30 unido mediante maleimida a una concentración de 650 micromolar. Incube la mezcla a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, mezcle las nanopartículas de HEV hasta alcanzar una concentración de un miligramo por mililitro con aproximadamente un 10% en volumen de LXY30 unido mediante maleimida, para obtener una relación molar de uno a tres. Reaccione durante la noche a cuatro grados Celsius. Debido a la concentración relativamente alta de LXY30 con maleimida, las concentraciones finales de reactivos como el sulfato de cobre se reducen aproximadamente 10 veces tras la mezcla. Para evitar el daño a las nanopartículas del virus de la hepatitis E, otra opción es el método de conjugación sin cobre.

Elimine el LXY30 con enlace maleimida no unido mediante una columna de desalación por centrifugación según el protocolo del fabricante. Mantenga las nanopartículas de HEV ligadas a LXY30 a cuatro grados Celsius. Para realizar la conjugación en un solo paso de las nanopartículas de HEV con LXY30 y la marca fluorescente Cy5.5, primero mezcle las nanopartículas ligadas a LXY30 hasta una concentración de un miligramo por mililitro con un volumen igual de la marca fluorescente Cy5.5 para obtener una relación molar de uno a cinco. Después de dejar reaccionar la mezcla durante la noche a cuatro grados Celsius, elimine el NHS Cy5.5 no unido mediante un procedimiento de columna de desalación por centrifugación según el protocolo del fabricante. Mantenga las nanopartículas de HEV ligadas a LXY30 y Cy5.5 a cuatro grados Celsius.

Se intentaron dos métodos para la funcionalización de nanopartículas HEV con LXY30 con el fin de dirigirse a células tumorales. Cuando las nanopartículas HEV 573C se unieron primero al azida maleimida, seguido de una reacción de química click con alquino LXY30, las nanopartículas HEV 573C parecieron desensamblarse al observarlas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Sin embargo, una reacción inicial de química click entre el alquino LXY30 y la azida maleimida para formar LXY30 unido al maleimida, seguida de la conjugación con nanopartículas HEV modificadas, no afectó su estructura y las nanopartículas HEV 573C permanecieron intactas. Las nanopartículas HEV unidas a LXY30 y Cy5.5 se aplicaron a células de cáncer de mama en cultivo y se observaron mediante microscopía confocal. Las imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano obtenidas por microscopía confocal indican que las nanopartículas HEV unidas a LXY30 y Cy5.5 tuvieron una mayor afinidad de unión y una mayor internalización en células de cáncer de mama MDA MB-231 en comparación con las nanopartículas HEV unidas únicamente a Cy5.5.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el examen de moléculas terapéuticas y de direccionamiento multimodal que permiten un targeting preciso y el diagnóstico de tumores sin causar daño a las células normales. Aunque este método puede proporcionar información sobre el cáncer y el direccionamiento de tumores mediante la modularización química de la superficie, puede aplicarse al diagnóstico temprano del cáncer, al cribado y al tratamiento guiado por imágenes.