Evaluación de la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara
10 de julio de 2018
El objetivo del presente artículo es proporcionar una descripción detallada de los procedimientos recomendados para evaluar la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara.
Esta técnica ayudará a abordar cuestiones clave en varios campos, como la investigación respiratoria, la seguridad, la farmacología y el desarrollo de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona lecturas en las que se puede confiar para evaluar la función respiratoria en animales conscientes, tanto al inicio como durante las pruebas. La técnica es especialmente útil cuando el protocolo experimental requiere poca desviación del estado fisiológico normal de los animales.
El animal está inmovilizado, pero por lo demás respira normalmente, lo que permite evaluar el patrón de respiración, además de la obstrucción de las vías respiratorias. El día del experimento, inicie una sesión experimental y cargue el archivo de configuración adecuado. Introduce el experimento y la información del animal.
Una vez hecho esto, haga clic en el botón ejecutar en la parte inferior de la ventana. Proceda con la calibración del sistema. Calibre cada sitio y señal de entrada por separado.
Encienda el generador de flujo de polarización conectado a la cámara principal a través de un trozo de tubería y ajuste el caudal. Cierre la abertura superior de la cámara principal con una tapa. Separe el panel posterior de la cámara torácica.
A continuación, inserte firmemente la herramienta de calibración dentro de la abertura de goma entre el cabezal y la cámara del cuerpo para crear un sello hermético. Cierre y vuelva a colocar el panel posterior de la cámara torácica. En el menú de la barra de herramientas del software, vaya a Ajuste y, a continuación, a Calibrar.
Vaya a Entrada uno y seleccione calibrar para iniciar el cuadro de diálogo de calibración para la señal de flujo torácico. Verifique que los parámetros enumerados en la ventana de diálogo de calibración muestren la configuración adecuada. El valor bajo de la tensión física aplicada debe ser cero.
El valor alto de tensión física aplicado debe ser de menos 20 mililitros por segundo y las muestras deben configurarse para integrarse. Una vez hecho esto, haga clic en bajo en la ventana de muestras. Verifique que la señal generada sea constante en toda la ventana de visualización y luego haga clic en cerrar.
Conecte una jeringa de 20 mililitros a través del puerto lateral de la cámara torácica mediante un conector de plástico en un trozo de tubo. Seleccione alto en la ventana de muestras e inyecte inmediatamente 20 mililitros de aire en la cámara durante un período de dos segundos a un caudal lo más constante posible. Verifique que la señal generada aparezca completamente dentro de la ventana de visualización.
Utilice el icono de flecha para verificar si la señal está centrada y es simétrica alrededor de la línea cero. A continuación, haga clic en cerrar. Elimine cualquier desplazamiento de cero haciendo clic en Eliminar desplazamiento de CA en la ventana de muestras.
Calibre la cámara principal de manera similar a la cámara torácica seleccionando la entrada número dos. Esta vez, establezca el valor alto en más 20 mililitros por segundo en lugar de menos 20. Trabaje en un área tranquila alejada de la habitación de la vivienda.
Aclimatar a los animales al sistema de retención y a los procedimientos antes del inicio del experimento. Debido a que no es invasivo y no requiere anestesia, trabajar en condiciones en las que el animal esté cómodo, bien adaptado y tranquilo limitará la propensión a las fugas de pelo entre las cámaras y, por lo tanto, maximizará la calidad de los datos. Pesar a los animales.
Seleccione el sistema de retención adecuado para el animal. Inserte el animal dentro del sujetador procediendo de la abertura trasera. Sostener el dispositivo verticalmente puede ser útil.
Una vez que el animal esté en posición, inserte el émbolo trasero y asegúrelo suavemente en su lugar sin aplicar una fuerza excesiva. Comprobar visualmente que el animal respira con normalidad. Si es necesario, ajuste su posición moviendo el mecanismo de bloqueo.
Asegúrese de que las narinas del animal sobresalgan fuera del cono de la nariz con su hocico apoyado contra las paredes internas del sujetador. Separe el panel posterior de la cámara torácica. Inserte el sujetador que contiene el animal a través de la abertura de goma en la cámara torácica y cierre la cámara.
Coloque la cámara de la cabeza, proporcione un flujo de polarización y permita que el animal se relaje durante al menos cinco minutos. Una vez que el animal esté tranquilo, inicie el protocolo de comandos seleccionando el primer paso y luego haga clic en Ejecutar. Compruebe en la pantalla del ordenador que las señales respiratorias del animal son regulares y suaves.
El software muestra automáticamente los parámetros calculados respiración por respiración. Verifica que los parámetros del animal sean estables. Registre el patrón de respiración en condiciones de referencia durante un máximo de 10 minutos.
En el caso de los protocolos que impliquen la administración de una sustancia problema por aerosol, en primer lugar, ajuste el nebulizador a tiempo y ciclo de trabajo según sea necesario. Realice un desafío de vehículos y registre la respuesta. Si es necesario, exponga al animal a concentraciones crecientes de la sustancia problema cambiando la concentración en el nebulizador y escalando las etapas.
Registre la respuesta después de cada administración. En este ejemplo se prueban 15 miligramos por mililitro de metacolina. El aumento máximo en la resistencia específica de las vías respiratorias se registra un momento después y luego se observa que vuelve lentamente al valor basal.
Al final de la sesión experimental, devuelva al animal a su habitación y jaula de alojamiento. Entre sesiones, limpie las cámaras del pletismógrafo y enjuague el nebulizador con agua. Proceda al análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.
Aquí se muestra el resultado de una evaluación repetida de la función respiratoria al inicio del estudio durante tres días consecutivos en dos grupos de ratones BALB/c. Un control y otro con inflamación alérgica pulmonar. Se obtuvieron valores estables y comparables para una selección de parámetros proporcionados por la pletismografía bicameral.
Estos valores se graficaron para la frecuencia respiratoria, el volumen del título, la ventilación por minuto, la pausa inspiratoria final, el flujo al volumen espiratorio medio del título y la resistencia específica de la vía aérea. Los cambios en la función respiratoria y la respuesta al aumento de las dosis de metacolina inhalada también se realizaron en días sucesivos para evaluar el grado de respuesta en ratones control y alérgicos C57BL/6. Los resultados muestran el aumento progresivo esperado en la resistencia específica de las vías respiratorias con dosis crecientes de metacolina con un grado exagerado de respuesta en los ratones alérgicos en el segundo y en el tercer día.
Al día siguiente se midió la resistencia newtoniana con la técnica de oscilación forzada. Los cambios en este parámetro reflejan principalmente variaciones en la resistencia de las grandes vías respiratorias conductoras. La resistencia newtoniana medida al inicio y en respuesta a la metacolina se correlacionó bien con la resistencia específica de la vía aérea medida obtenida el día anterior en los mismos animales.
Esta técnica es conveniente para evaluar a numerosos animales a la vez, para capturar la cinética de una respuesta aguda, así como para medir la función respiratoria de manera repetida durante un experimento que duró varios días. Después del procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la técnica de asociación forzada para complementar la evaluación con mediciones directas de la mecánica respiratoria como la resistencia de la vía aérea. La pletismografía de doble cámara proporciona un enfoque realmente interesante para evaluar el patrón de respiración y la geografía de la obstrucción de las vías respiratorias, especialmente cuando el protocolo experimental requería que los animales estuvieran conscientes.
Descripción general
Este artículo detalla los procedimientos para evaluar la función respiratoria en ratones conscientes mediante plestimografía de doble cámara. Esta técnica es fundamental para la investigación respiratoria y el desarrollo de fármacos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación respiratoria
- Farmacología de seguridad
- Desarrollo de fármacos
Antecedentes
- La plestimografía de doble cámara permite evaluar la función respiratoria sin anestesia.
- La técnica mantiene el estado fisiológico normal del animal.
- Proporciona datos confiables sobre los patrones de respiración y la obstrucción de las vías aéreas.
- La aclimatación de los animales es esencial para la calidad de los datos.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la evaluación de la función respiratoria en ratones.
- Mejorar la comprensión de las respuestas respiratorias en diversas condiciones.
- Facilitar las pruebas de fármacos y las evaluaciones de seguridad.
Métodos Utilizados
- Calibración del sistema de pletismografía.
- Restricción de los animales de una manera cómoda.
- Registro de los patrones respiratorios basales.
- Administración de sustancias de prueba mediante aerosol.
Resultados principales
- Se registraron parámetros respiratorios estables durante días consecutivos.
- Se evaluaron las respuestas a la metacolina en ratones control y alérgicos.
- Se observó un aumento de la resistencia de las vías respiratorias con dosis crecientes de metacolina.
- Los datos mostraron diferencias significativas en la respuesta entre los grupos.
Conclusiones
- La plestimografía de doble cámara es efectiva para la evaluación de la función respiratoria.
- El método proporciona datos confiables tanto para estados basales como para estados desafiados.
- Es adecuada para evaluar los efectos de fármacos en la investigación respiratoria.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación de la función respiratoria en animales conscientes es fundamental para la farmacología de seguridad preclínica y el desarrollo de fármacos respiratorios, ya que mantener la relevancia fisiológica mejora la confianza en la traslación. La plestimografía de doble cámara permite mediciones no invasivas y repetidas de los patrones respiratorios y la resistencia de las vías aéreas en ratones sin restricción que respiran espontáneamente, lo que apoya la eliminación de riesgos mecanicistas de terapéuticos inhalados. La técnica proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles que se alinean con los flujos de trabajo desde el descubrimiento inicial hasta la optimización de fármacos líderes, al ofrecer datos confiables de línea base y de respuesta a desafíos sin interferencias anestésicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con las vías de reactividad de las vías respiratorias y broncoconstricción en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas al medir salidas fisiológicas en animales conscientes bajo condiciones basales y tras estímulos.
- Valor predictivo: Proporciona lecturas de la función respiratoria que ayudan a reducir el riesgo de interacción con la diana y del mecanismo de acción en programas de fase inicial.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Proporciona parámetros estandarizados y cuantitativos, como la resistencia específica de las vías respiratorias, el volumen tidal y la ventilación minuto, para la selección de compuestos.
- Reproducibilidad: Permite el monitoreo paralelo de múltiples animales y evaluaciones repetidas durante varios días, mejorando la solidez del ensayo.
- Escalabilidad: Compatible con la administración de sustancias en forma de aerosol, lo que facilita el perfilado de respuesta a la dosis en farmacología de seguridad.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Utilidad demostrada en modelos de inflamación alérgica, que permite la evaluación de correlaciones genotipo-fenotipo en enfermedades respiratorias.
- Continuidad traslacional: Conecta fenotipos respiratorios de fase de descubrimiento con validación preclínica mediante mediciones consistentes y libres de anestesia.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Facilita evaluaciones de avance/no avance al cuantificar la respuesta a agentes broncoconstrictores como la metacolina en grupos experimentales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica, especialmente para programas terapéuticos respiratorios e inhalados que requieren puntos finales funcionales respiratorios.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre los mecanismos de obstrucción de las vías respiratorias y la modulación de vías en modelos genéticos o de enfermedad.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos y la cuantificación reproducible de parámetros respiratorios para la evaluación del efecto de compuestos.
- Análisis: Proporciona parámetros calculados por cada respiración, incluyendo la resistencia específica de la vía aérea y métricas de flujo, para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traducional: Mantiene la continuidad fisiológica desde el descubrimiento in vivo hasta los estudios preclínicos, al evitar artefactos provocados por anestésicos.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para el monitoreo respiratorio longitudinal en múltiples estudios y series de compuestos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al proporcionar datos respiratorios fisiológicamente relevantes en animales conscientes y sin restricciones.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización, la reproducibilidad y un sesgo procedural mínimo mediante la aclimatación y el control de flujo de base.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al reducir los falsos positivos derivados de artefactos respiratorios inducidos por anestesia o estrés.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos respiratorios basada en mediciones validadas y repetibles de la resistencia de las vías aéreas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de animales, el uso de dispositivos de inmovilización y la operación del sistema de pletismografía.
- Depende de instrumentación calibrada, generadores de flujo de polarización y sistemas nebulizadores para la administración de aerosoles.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de aclimatación y de los controles ambientales para minimizar la variabilidad de los datos.
- Implica consideraciones de adaptación entre cepas de ratones y modelos de enfermedad, como se ha demostrado en cepas BALB/c y C57BL/6.
- Está limitado por posibles fugas del pelo y la integridad del sellado de la cámara, lo cual puede mitigarse mediante una adecuada aclimatación de los animales y condiciones experimentales silenciosas.
