Forzado de la salivación como un método para analizar la competencia de vectores de mosquitos
7 de agosto de 2018
Para el eficiente control de mosquito transmitidas por transmisión del virus, el conocimiento del potencial vector de mosquitos respectivos es de particular interés. Describimos la salivación forzada como un método para analizar la competencia vectorial de Aedes albopictus y tres taxones diferentes de Culex para la transmisión del virus Zika.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades transmitidas por mosquitos, como si una especie de mosquito es o no un vector competente para un determinado virus. La principal ventaja de este método es que se puede analizar una gran cantidad de mosquitos simultáneamente, sin el uso de animales de laboratorio como ratones. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque necesita habilidades motoras finas que solo se pueden adquirir con la práctica.
La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que los pasos clave son difíciles de aprender; Requieren experiencia en el manejo de mosquitos y virus, y también habilidades motoras finas. Para empezar, diluya el stock de virus. A continuación, mezcle la sangre humana caducada con la fructosa, el suero bovino filtrado y el caldo de virus.
Congele 140 microlitros de mezcla de harina de sangre para su posterior análisis a través de TCID50. A continuación, coloque dos gotas de 50 microlitros de la mezcla de harina de sangre en un vial de plástico y deje que los mosquitos se alimenten durante dos horas. Después de anestesiar a los mosquitos, cuente los individuos completamente hinchados y transfiéralos a un nuevo frasco que contenga una almohadilla de algodón empapada en fructosa.
Luego, mantenga los mosquitos a 27 grados centígrados y 80% de humedad durante 14 o 21 días. Reponga las almohadillas de algodón saturadas de fructosa cada 72 horas con 1,5 mililitros de fructosa. Primero, siembre 20.000 células Vero por pocillo en una placa de 96 pocillos con medio de crecimiento suplementado.
Para preparar el dispositivo de salivación, coloque una placa de vidrio cuadrada sobre el banco en un ángulo de 30 grados. Luego, adhiera cinta adhesiva de doble cara a la parte superior de la placa de vidrio. A continuación, enrolle la arcilla para modelar hasta que tenga 0,5 centímetros de diámetro y fíjela a la placa horizontalmente a un centímetro de distancia de la cinta de doble cara.
Corte las puntas del número requerido de puntas de filtro de 10 microlitros y llene cada punta con 10 microlitros de PBS. Luego, coloque las puntas sobre la arcilla para modelar y asegúrelas con una presión suave. A continuación, inmovilice a los mosquitos quitándoles las patas y las alas.
Fije los mosquitos a la cinta adhesiva sobre las puntas del filtro. Coloque suavemente la probóscide de cada mosquito en la punta de un filtro. Después de 30 minutos, retire las puntas del filtro y deseche la arcilla y la cinta adhesiva.
Transfiera la saliva recolectada a tubos de reacción que contengan 10 microlitros de PBS. Mezcle la saliva y el PBS suavemente y transfiera la mezcla a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Incubar la placa durante siete días a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Con un microscopio óptico, verifique la presencia de efecto citopático en las células. Una vez que un pocillo es positivo para el efecto citopático, use una pipeta para cosechar 140 microlitros del sobrenadante. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo de reacción.
A continuación, mezcle 140 microlitros del sobrenadante con 560 microlitros de tampón AVL e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, agregue 560 microlitros de etanol e invierta la muestra para mezclar. Utilizando este protocolo, varias especies de mosquitos fueron analizadas para detectar la infección y transmisión del virus del Zika en diversas condiciones climáticas.
En condiciones de incubación a 27 grados centígrados, todas las especies de Aedes mostraron saliva positiva para el virus del Zika. Por el contrario, ninguna de las muestras de saliva de los taxones de Culex contenía evidencia del virus. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar para 50 mosquitos en una hora si se realiza correctamente.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de salivación forzada. No olvide que trabajar con mosquitos infectados puede ser muy peligroso, por lo que siempre se deben tomar medidas de seguridad especiales para el manejo de mosquitos en condiciones BSA-3 al realizar cualquier experimento.
Resumen
Este artículo describe un método para analizar la competencia vectorial de mosquitos, específicamente Aedes albopictus y diversos taxones de Culex, en la transmisión del virus del Zika. La técnica de salivación forzada permite el análisis simultáneo de múltiples mosquitos sin el uso de animales de laboratorio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de vectores
- Virología
- Enfermedades transmitidas por mosquitos
Antecedentes
- Comprender la competencia vectorial es fundamental para controlar los virus transmitidos por mosquitos.
- La sialorrea forzada es un método novedoso para evaluar el potencial de transmisión de mosquitos.
- Los métodos anteriores a menudo requerían animales de laboratorio, algo que esta técnica busca eliminar.
- Las habilidades motoras finas son esenciales para este método, lo que exige práctica y experiencia.
Objetivo del estudio
- Evaluar la competencia vectorial de diferentes especies de mosquitos para el virus de Zika.
- Demostrar un método que permita el análisis de alto rendimiento de la saliva de mosquitos.
- Proporcionar una guía visual para investigadores nuevos en la técnica.
Métodos Utilizados
- Preparación de una mezcla de comida sanguínea para la alimentación de mosquitos.
- Técnica de salivación forzada para recolectar saliva de mosquitos.
- Métodos de cultivo celular para evaluar la presencia del virus del Zika.
- Incubación y análisis de muestras para efectos citopáticos.
Resultados Principales
- Las especies de Aedes mostraron saliva positiva para el virus Zika bajo condiciones controladas.
- Los taxones de Culex no exhibieron evidencia del virus Zika en su saliva.
- El método permite la prueba de hasta 50 mosquitos en una hora, una vez dominado.
- Las demostraciones visuales facilitan significativamente el aprendizaje de la técnica.
Conclusiones
- La sialorrea forzada es un método eficaz para estudiar la transmisión de virus transmitidos por mosquitos.
- La capacitación y la práctica son esenciales para la implementación exitosa de la técnica.
- Se deben seguir medidas de seguridad al manipular mosquitos infectados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los ensayos de salivación forzada permiten la evaluación de alto rendimiento de la capacidad vectorial de mosquitos sin recurrir a modelos animales, apoyando la validación temprana de objetivos en el descubrimiento de antivirales. El método proporciona la detección cuantitativa de virus con capacidad de replicación a partir de insectos individuales, aportando información clave para decisiones de avance o interrupción del desarrollo de candidatos profilácticos o terapéuticos contra arbovirus. Su escalabilidad y reproducibilidad aumentan la confianza predictiva en la reducción de riesgos preclínicos de intervenciones que bloquean la transmisión.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la medición del potencial de transmisión viral en vectores individuales de enfermedades.
- Valor operativo: Permite la eliminación biológica de riesgos en dianas mediante la evaluación directa de la competencia vectorial en condiciones controladas.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar especies vectoriales no competentes, reduciendo los falsos positivos en los programas de arbovirus.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos antivirales posteriores mediante la confirmación de la susceptibilidad viral en modelos vectoriales.
- Valor operativo: Estandariza la recolección de saliva y la detección de virus, asegurando resultados cuantitativos reproducibles en grandes cohortes de mosquitos.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma para la evaluación de alto rendimiento de compuestos o vacunas que bloquean la transmisión.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad al probar la competencia vectorial bajo temperaturas epidemiológicamente relevantes (18–27°C).
- Valor operativo: Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante lecturas de virus basadas en saliva consistentes.
- Reducción de riesgos: Orienta las decisiones de avance al establecer umbrales de transmisión dependientes de la temperatura para los candidatos principales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método de sialorrea forzada se enmarca dentro del continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica, particularmente para intervenciones dirigidas contra arbovirus.
- Biología de descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de rutas al cuantificar la presencia del virus en la saliva de mosquitos como una medición funcional del potencial de transmisión.
- Selección: Proporciona disponibilidad y reproducibilidad del ensayo mediante la recolección estandarizada de saliva y la detección de virus equivalente a TCID50 en células Vero.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes (título viral en saliva) que permiten comparaciones entre especies, cepas y condiciones ambientales.
- Investigación traslacional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante datos de transmisión estratificados por temperatura que reflejan ventanas de transmisión relevantes para el campo.
- Reutilización empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable para seleccionar múltiples arbovirus (por ejemplo, ZIKV, DENV, CHIKV) en distintas especies vectoras sin necesidad de reoptimización.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos, reducción de la ambigüedad mecanicista en la biología de la transmisión.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad entre equipos de entomología y virología.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas en programas antivirales.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo y decisiones de avance basadas en datos empíricos de competencia vectorial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de mosquitos, virología y técnicas microquirúrgicas bajo contención BSL-3.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo dispositivos de salivación, incubadoras con control preciso de humedad y microscopía para la evaluación de efectos citopáticos.
- Necesita la estandarización entre equipos en la preparación de las comidas sanguíneas, los tiempos de incubación y los intervalos de recolección de saliva.
- Las consideraciones de adaptación incluyen el tamaño específico de la probóscide, el comportamiento alimenticio y la morfología de las glándulas salivales en diferentes modelos de vectores.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de una formación extensa para alcanzar competencia y la dependencia del método respecto al aislamiento de virus viables a partir de la saliva.
