Evaluación de la interacción entre el complemento proteína C1q y el ácido hialurónico en la promoción de la adhesión celular
15 de junio de 2019
El componente de complemento C1q es una molécula proinflamatoria altamente expresada en el microambiente tisular que puede interactuar con la matriz extracelular. Aquí, describimos un método para probar cómo C1q unido al ácido hialurónico afecta la adhesión celular.
Un procedimiento integral para evaluar la interacción entre la proteína de complemento C1q y el ácido hialurónico en la promoción de la adhesión celular. Recientemente hemos definido que el componente de complemento C1q una molécula del sistema inmunitario innato está muy expresada en el microambiente tumoral y placenta y es capaz de interactuar con el componente de la matriz extracelular. En este caso, ácido hialurónico.
Proponemos un método para estudiar las funciones biológicas de las proteínas en todo el entorno ecronómico. Con el fin de investigar la capacidad de estas moléculas para dar forma a las propiedades de división celular de los factores de matriz extracelular. Con el fin de estudiar cómo esta interacción puede ser detectada por las células presentes en el tejido del medio ambiente, configuramos este método fácil en el que las células binarias derivadas de los tejidos humanos se les permitió adherirse a C1q unido a la matriz extracelular, en este caso ácido hialurónico.
Para el procedimiento de recubrimiento el primer paso es la unión de ácido hialurónico de alto peso molecular a 96 microplacas bien recubiertas de tejido. Para el recubrimiento, el ácido hialurónico se diluye en 0,1 mole buffer de carbono PH 9.6 a una concentración de 15 microgramos por mililitro. Y la tubería suave es requited para lograr una solución homogénea.
Se utilizan 100 microlitros de la solución para recubrir los pozos. La placa se transfiere a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente aspira el vacío de los pozos tratados.
Lavar una vez con dPBS. Agregue C1q o BSA en los pozos correspondientes. C1q está actualmente disponible comercialmente a una concentración de un miligramo por mililitro y se diluye a una concentración de 25 microgramos por mililitro.
Y dPBS que contiene 0.5%BSA y 0.7 milimolemoles calcio y magnesio y cationes divalentes. BSA LPS free se utiliza a la concentración de 0.5% y fecha PBF. La placa se transfiere a cuatro grados centígrados durante la noche.
Las interacciones dependientes de la dosis C1q con ácido hialurónico inmovilizado se determinan mediante inmuno SA vinculado a enzimas. Etiquetado de células con DiI rápido. El trazador lipofílico diI rápido se utiliza para etiquetar las células de interés. Las células resuspendidas en dPBS se utilizan a la concentración de un millón de células por mililitro.
DiI rápido se diluye de uno a 100 directamente en la suspensión celular. La suspensión celular se mezcla manualmente y se transfiere a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de cinco minutos de incubación, mezcle la suspensión celular y repita esta operación dos veces más.
Para eliminar el exceso de DiI rápido, agregue 10 mililitros de dPBS. Gire suavemente hacia arriba y hacia abajo y centrifugar a 250 g durante siete minutos. Resuspender el gránulo celular en un mililitro de medio libre de suero endofilo humano en presencia de 0.1%BSA.
Adhesión de células en matrices C1q de ácido hialurónico. Aspirar al vacío el dPBS de los pozos recubiertos. Distribuya 100 microlitros de suspensión celular etiquetada a los pozos recubiertos.
200 microlitros de células etiquetadas se desmontan en un tubo de ependure que se utilizará para la generación de curvas estándar. Incubar la placa durante 35 minutos a 37 grados centígrados. Saque el plato de la incubadora.
Aspirar suavemente las células desequilibradas. Lavar una vez con dPBS que contiene 0.5%BSA y 0.7 milimolemoles de calcio y magnesio. Lys las células adherentes mediante la adición de 200 microlitros de tampón de lelisis.
Al mismo tiempo, prepare la curva estándar sobre una o dos diluciones en serie de las células etiquetadas en el búfer de lelisis. Realice la lectura de la señal de florescencia en el infinito instrumento F 200 T-can utilizando 544 nanómetros como longitud de onda de excitación y 590 nanómetros como longitud de onda de emisión. Resultados representativos.
Como muestran los resultados representativos, es evidente que la adhesión celular en el ácido hialurónico encontró C1q como fuertemente mejorado en comparación con HA solo o HA unido BSA. El porcentaje de celdas adherentes en cada matriz se calcula sobre la base de la curva estándar. Conclusiones. En nuestros experimentos primero evaluamos la capacidad del componente de complemento C12 para unir la matriz extracelular en este caso el ácido hialurónico utilizando un metal arisal.
En segundo lugar analizamos la capacidad de las células primarias humanas manchadas con tinte fluorescente para perseguir el ácido hialurónico unido. El modelo que propusimos en este estudio es un método más fácil y barato en alternativa al modelo 3D de andamios de matriz extracelular para la evaluación de esta respuesta celular a una combinación de estímulos.
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Descripción general
Este estudio explora la interacción entre el componente del complemento C1q y el ácido hialurónico, centrándose en cómo esta interacción influye en la adhesión celular. C1q, una molécula proinflamatoria, se expresa significativamente en los microentornos tumorales y placentarios.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Inmunología
Antecedentes
- La C1q forma parte del sistema inmunitario innato.
- Se expresa altamente en microentornos tisulares específicos.
- La C1q interactúa con componentes de la matriz extracelular.
- El ácido hialurónico es un componente clave de la matriz extracelular.
Objetivo del estudio
- Evaluar el papel del C1q en la adhesión celular.
- Investigar cómo el C1q unido al ácido hialurónico afecta el comportamiento celular.
- Desarrollar un método para estudiar las interacciones proteicas en el entorno extracelular.
Métodos Utilizados
- Se utilizaron células binarias derivadas de tejidos humanos.
- Se permitió que las células se adhirieran a C1q unido al ácido hialurónico.
- Se estableció un procedimiento integral para la evaluación.
- Las funciones biológicas de las proteínas se evaluaron en el contexto de la matriz extracelular.
Resultados principales
- La interacción entre C1q y el ácido hialurónico promueve la adhesión celular.
- Las células responden a la presencia de C1q en la matriz extracelular.
- Este método proporciona información sobre las propiedades de la división celular influenciadas por factores extracelulares.
- Los hallazgos podrían tener implicaciones para comprender las respuestas inmunitarias en entornos tisulares.
Conclusiones
- La C1q desempeña un papel importante en la adhesión celular mediante su interacción con el ácido hialurónico.
- El método desarrollado puede aplicarse para estudiar más a fondo las interacciones proteicas.
- Comprender estas interacciones podría mejorar el conocimiento sobre las funciones del sistema inmunitario en diversos tejidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender cómo la proteína del complemento C1q modula componentes de la matriz extracelular como el ácido hialurónico proporciona una perspectiva mecanicista sobre las interacciones tumor-estroma que impulsan la progresión mediada por adhesión. Este ensayo permite la desaceleración temprana de objetivos implicados en la remodelación del microentorno al cuantificar cómo las señales de origen inmunitario alteran el comportamiento celular dependiente de la matriz. El método apoya la validación de objetivos en inmuno-oncología al vincular efectores inmunitarios innatos con cambios funcionales en la matriz extracelular relevantes para la competencia metastásica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Investiga cómo la unión de C1q al ácido hialurónico altera las propiedades de la matriz para influir en la adhesión de células tumorales, lo que respalda la validación funcional de mediadores del microentorno.
- Valor operativo: Permite la comprobación de hipótesis sobre la remodelación de la matriz impulsada por el complemento en un formato controlado y reproducible utilizando células primarias derivadas de tumores humanos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas basadas en fluorescencia de la adhesión celular a matrices de C1q-HA, permitiendo el análisis de respuesta frente a dosis de interacciones proteína-matriz.
- Valor operativo: Utiliza un protocolo estandarizado de recubrimiento en placas de 96 pocillos con concentraciones definidas de HA (15 µg/mL) y C1q (25 µg/mL) para garantizar la reproducibilidad del ensayo en campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Modela cómo el C1q expresado por el tumor reconfigura la adhesión mediada por ácido hialurónico, ofreciendo un sistema relevante para la enfermedad que permite estudiar la activación del estroma en la neoplasia.
- Valor operativo: Conecta el descubrimiento con el trabajo preclínico al proporcionar un método escalable para evaluar intervenciones dirigidas a la matriz utilizando células humanas relevantes clínicamente como insumo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la interacción con el blanco hasta la selección fenotípica, donde la adhesión dependiente de la matriz sirve como lectura funcional de la modulación de la vía en el microambiente tumoral.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al evaluar si la interacción C1q-HA induce fenotipos proadhesivos en células tumorales humanas primarias.
- Tamizaje: Proporciona salidas cuantitativas estandarizadas de adhesión compatibles con la evaluación de medio rendimiento de moduladores de la unión proteína-matriz.
- Análisis: La cuantificación de la señal de fluorescencia mediante una curva patrón permite comparaciones precisas de las condiciones de adhesión entre matrices de HA, C1q-HA y BSA-HA.
- Investigación Traducional: Utiliza células derivadas de tumores humanos y componentes de matriz fisiológicamente relevantes para aumentar la confianza traslacional en estrategias de targeting del microambiente.
- Reutilización Empresarial: La plataforma puede adaptarse para estudiar otras proteínas de la matriz extracelular y mediadores inmunitarios más allá de C1q y HA, favoreciendo la estandarización entre proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la comunicación tumor-estroma al aislar el efecto del C1q en la adhesión dependiente de ácido hialurónico.
- Valor operativo: Los pasos definidos de recubrimiento y bloqueo (por ejemplo, incubación nocturna a 4 °C, lavados con dPBS) promueven la estandarización del ensayo y la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar al cuantificar cómo las interacciones inmuno-matriz influyen en comportamientos tumorigénicos tempranos, como el crecimiento dependiente de la anclaje.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas implicadas en la interacción complemento-matriz basada en resultados funcionales de adhesión.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en recubrimiento de proteínas, cultivo celular y técnicas de cuantificación basadas en fluorescencia.
- Depende del acceso a lectores de microplacas con capacidad de fluorescencia con excitación a 544 nm y emisión a 590 nm para la detección rápida de DiI.
- Necesita la estandarización de los protocolos de marcado celular (por ejemplo, dilución del DiI rápido, tiempos de incubación) para garantizar una señal consistente entre experimentos.
- La adaptación a otras proteínas de matriz puede requerir la optimización de los tampones de recubrimiento y las condiciones de incubación para mantener la funcionalidad proteica.
- Las limitaciones incluyen la dependencia de modelos de adhesión en 2D, que pueden no captar completamente la complejidad estromal en 3D observada in vivo.
