Medición de interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterologoso
22 de mayo de 2020
Aquí, presentamos un protocolo optimizado para medir rápida y semicuantitativamente las interacciones ligando-receptor en trans en un sistema celular heterologoso utilizando microscopía de fluorescencia.
El ensayo basado en células permite la observación y cuantificación de las interacciones de transadhesión sin necesidad de largas purificaciones de proteínas ni equipos especializados. Aunque las interacciones de proteínas probadas aquí son relevantes para la neurobiología, este método puede aplicarse a cualquier área de investigación en la que la adhesión de proteínas se produzca intercelularmente. 48 horas después de transfectar las células HEK-293T, recoja las células de la placa de seis pocillos para su agregación.
Primero, lave cada pocillo dos veces con PBS. A continuación, para disociar suavemente las células, agregue un mililitro de EDTA 10 milimolar a cada pocillo, luego incube la placa a 37 grados centígrados. Después de cinco minutos de incubación, golpee suavemente la placa para separar las células y coseche cada pocillo en un tubo cónico separado de 15 mililitros.
Centrifugar los tubos a 500 x g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Mientras se granulan las células, prepare seis tubos de incubación etiquetando la parte superior de los tubos de microcentrífuga con las condiciones experimentales. Se deben utilizar todas las permutaciones de GFP y mCherry.
Retire el sobrenadante de los tubos cónicos de 15 mililitros y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de medio. Con un hemocitómetro, cuente las células de cada tubo cónico. A continuación, alícuota 200.000 células de cada condición en el tubo de incubación adecuado para una mezcla uno a uno en un volumen total de 500 microlitros.
Después de evaluar la agregación basal descrita en la siguiente sección, coloque los tubos de incubación en un rotador lento de tubos a temperatura ambiente. Para evaluar la agregación, al inicio y de nuevo después de 60 minutos, pipetear 40 microlitros del tubo de incubación en un portaobjetos de microscopio cargado. La adquisición de la línea de base debe realizarse lo más rápido posible después de la adición de células al tubo de microcentrífuga.
Imagine el portaobjetos bajo fluorescencia en los canales verde y rojo. Para cada diapositiva, capture imágenes de tres campos de visión diferentes en un plano focal. Las células HEK-293T se transfectaron con una proteína de interés, una proteína mutada de interés o un ligando de interés y se transfectaron conjuntamente con una proteína fluorescente.
Las poblaciones celulares que expresaban la proteína de interés se mezclaron con las poblaciones celulares que expresaban el ligando de interés y se evaluó la agregación después de 60 minutos. En las superposiciones de imágenes capturadas en los canales verde y rojo, la agregación aparece como puntos amarillos. Las condiciones en las que las células no expresaban ningún ligando sináptico mostraron una agregación mínima.
Además, se exhibió una agregación mínima cuando solo una de las dos poblaciones expresaba ligandos sinápticos. No se exhibió agregación cuando las dos poblaciones de células expresaron moléculas de adhesión incompatibles. Las condiciones con moléculas de adhesión compatibles mostraron una agregación significativa después de una incubación de 60 minutos.
Sorprendentemente, la proteína mutada de interés exhibió significativamente más agregación que su contraparte de tipo salvaje, lo que sugiere que la mutación puntual mejora las capacidades de unión de las proteínas. Las mutaciones en muchas moléculas de adhesión se relacionan comúnmente con trastornos del neurodesarrollo, neuropsiquiátricos y de adicción. Con esta técnica, se pueden examinar los efectos de las mutaciones puntuales relevantes de la enfermedad en las interacciones trans.
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Resumen
Este estudio presenta un protocolo optimizado para medir de forma rápida y semicuantitativa interacciones ligando-receptor en trans, utilizando un enfoque de microscopía de fluorescencia en células HEK-293T. El método permite la cuantificación de interacciones de adhesión proteica relevantes para la neurobiología y posiblemente otras áreas de investigación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurobiología
- Adhesión celular
- Interacciones de proteínas
Antecedentes
- Las interacciones ligando-receptor son fundamentales para la comunicación celular.
- Comprender estas interacciones ayuda a elucidar los mecanismos de los trastornos neurodesarrolladores y neuropsiquiátricos.
- Los métodos tradicionales pueden requerir una extensa purificación de proteínas o equipos especializados.
- Este estudio propone un enfoque más eficiente utilizando microscopía de fluorescencia.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo rápido y eficaz para estudiar la adhesión de proteínas en un ensayo basado en células.
- Evaluar cómo las mutaciones puntuales en las proteínas influyen en las interacciones trans.
- Aplicar ampliamente este método en estudios de adhesión proteica fuera de la neurobiología.
Métodos Utilizados
- Se empleó microscopía de fluorescencia para obtener imágenes de las interacciones celulares.
- Se utilizaron células HEK-293T como modelo biológico, centrándose en proteínas y ligandos transfectados.
- La cronología experimental incluyó la evaluación de la agregación celular a los 60 minutos posteriores a la transfección.
- El recuento celular se realizó mediante un hemocitómetro, seguido de la resuspensión celular y mezcla para la obtención de imágenes.
Resultados principales
- La agregación de células que expresan moléculas de adhesión compatibles se vio significativamente aumentada tras 60 minutos.
- Las proteínas mutadas mostraron una mayor agregación en comparación con las proteínas de tipo salvaje, lo que indica capacidades de unión mejoradas.
- Se observó una agregación mínima cuando ninguna o solo una población expresaba ligandos sinápticos.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método simplificado para evaluar las interacciones adhesivas intercelulares.
- Los hallazgos destacan el potencial de esta técnica para explorar los efectos de las mutaciones sobre las interacciones proteicas.
- Los conocimientos obtenidos mediante este método son valiosos para comprender los mecanismos subyacentes a diversos trastornos neurodesarrolladores y psicológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo permite la medición directa de interacciones proteína-proteína en trans en un contexto celular, abordando una limitación clave de los ensayos bioquímicos que no pueden distinguir entre unión en cis y en trans. Al cuantificar únicamente la adhesión intercelular fisiológicamente relevante, el método mejora la confianza en la validación de dianas y reduce los falsos positivos en las fases iniciales del descubrimiento. Además, permite la desactivación mecanicista de dianas de adhesión implicadas en trastornos neurodesarrolladores y neuropsiquiátricos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Analiza hipótesis terapéuticas mediante la medición de la adhesión funcional en trans entre pares de ligando y receptor expresados en células separadas.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de purificación de proteínas, lo que permite un cribado rápido de mutantes o variantes directamente en un sistema celular.
- Valor predictivo: El aumento de agregación con una mutación asociada a una enfermedad demuestra cómo el ensayo puede identificar variantes con ganancia de función para su priorización.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Utiliza células HEK marcadas con fluorescencia para generar lecturas cuantificables mediante imágenes (por ejemplo, puntos amarillos en superposiciones) para la adaptación a cribado de alto contenido.
- Reproducibilidad: Condiciones estandarizadas de mezcla e incubación celular permiten mediciones consistentes de agregación entre experimentos.
- Escalabilidad: El protocolo permite probar múltiples condiciones (por ejemplo, tipo silvestre frente a mutante, combinaciones de ligandos) en paralelo mediante pasos sencillos de mezclado y adquisición de imágenes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Evalúa directamente cómo las mutaciones puntuales en moléculas de adhesión—comunes en trastornos neurodesarrolladores, neuropsiquiátricos y de adicción—afectan las interacciones trans.
- Continuidad traslacional: Conecta los ensayos de unión in vitro con fenotipos celulares, apoyando decisiones de avance o interrupción basadas en datos funcionales de adhesión.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Determina si las mutaciones potencian o interrumpen la unión intercelular, lo que aporta información sobre el mecanismo del blanco terapéutico y el perfil de seguridad.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El ensayo se sitúa entre la selección de interacción con el objetivo y la validación funcional, aportando datos específicos sobre adhesión para orientar la optimización del fármaco líder y la selección del candidato preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa si las variantes genéticas alteran la adhesión intercelular, lo que permite aclarar vías y validar hipótesis sobre dianas moleculares.
- Analítica: Genera lecturas cuantitativas basadas en imágenes (formación de agregados a lo largo del tiempo) para comparar condiciones y evaluar la intensidad de las interacciones.
- Investigación Traducional: Relaciona cambios moleculares con fenotipos celulares relevantes para la formación de sinapsis y la conectividad neuronal.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a cualquier sistema de adhesión proteica intercelular, lo que la convierte en una plataforma reutilizable en diversas áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mide únicamente interacciones trans, lo que reduce la sobreestimación del enlazamiento observada en ensayos basados en lisados y mejora la especificidad del blanco.
- Valor operativo: Utiliza cultivos celulares estándar y microscopía de fluorescencia, sin requerir equipos especializados ni reactivos complejos.
- Valor estratégico: Permite una evaluación rápida de los efectos de las mutaciones sobre la función del blanco, apoyando decisiones más informadas de avance o descarte durante la identificación de candidatos.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo al identificar variantes con adhesión alterada que podrían influir en la eficacia o toxicidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la transfección de células de mamífero, etiquetado con proteínas fluorescentes y recuento celular mediante citometría de flujo o hemocitómetro.
- Depende de microscopía de fluorescencia con capacidad de imagen dual (por ejemplo, GFP y mCherry) y herramientas de análisis de imágenes para la cuantificación de agregados.
- Necesita la estandarización de los niveles de expresión celular y de las proporciones de mezcla para garantizar lecturas de agregación reproducibles entre diferentes equipos.
- La adaptación a sistemas no HEK puede requerir la optimización de la eficiencia de transfección y de la expresión en la superficie de moléculas de adhesión.
- Se limita a evaluar la adhesión; no informa sobre eventos de señalización downstream o de internalización posteriores a la unión.
