Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores

Los gliomas de alto grado, como el glioma pontino intrínseco difuso, son tumores altamente invasivos con una alta mortalidad. A pesar de años de extensa investigación, la barrera hematoencefálica es un aspecto importante porque la quimioterapia no puede llegar eficazmente al cerebro. Afortunadamente, el ultrasonido focalizado es capaz de abrir temporal y localmente la barrera hematoencefálica para tratamientos efectivos.

Desarrollamos un sistema de ultrasonido focalizado neuronavegado pequeño y rentable para la interrupción de la barrera hematoencefálica. Este sistema está construido con componentes disponibles en el mercado y con un alto grado de automatización, permite la realización de estudios preclínicos de evaluación de fármacos. La medicina de precisión se define como el fármaco adecuado en la dosis adecuada para el paciente adecuado en el momento adecuado.

Para lograr esto, muchos medicamentos preseleccionados deben ser examinados. Nuestro sistema compacto de ultrasonido focalizado de alto rendimiento para la interrupción de la barrera hematoencefálica nos permite hacer precisamente eso. Los encargados de demostrar el procedimiento serán Rianne Haumann y Elvin t Hart, dos estudiantes de doctorado de mi grupo de investigación.

El flujo de trabajo para la ecografía estereotáctica focalizada en la neuronavegación guiada por imágenes incluye la obtención de imágenes intervencionistas y el acoplamiento acústico para la sonoporación en la plataforma de ecografía. Posteriormente, se pueden realizar imágenes de seguimiento. Seleccione un transductor adecuado en función de los requisitos del experimento diseñado.

Colócalo en un cono impreso en 3D lleno de agua desgasificada y cerrado en la parte inferior con una membrana de Mylar acústicamente transparente. Conecte el transductor a un generador de funciones y a un amplificador de potencia. Monte el transductor en una platina lineal motorizada para el posicionamiento vertical automático y conéctelo al amplificador de potencia.

Utilice una plataforma estereotáctica desmontable que incluya calefacción con temperatura regulada, barras de mordida y orejas, anestesia y marcadores fiduciales multimodales. Fije la plataforma a la platina lineal 2D. Antes de que se pueda utilizar el sistema FUS, calícelo y determine el punto de enfoque del transductor.

El punto de enfoque corresponde a la posición vertical del animal en la plataforma estereotáctica. Aclimatar al animal a las instalaciones durante al menos una semana después de su llegada y péselo regularmente. El día del experimento, administre buprenorfina a través de una inyección subcutánea 30 minutos antes del tratamiento con FUS.

Después de anestesiar al ratón, aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad ocular. Si es necesario, retire el pelo de la parte superior de la cabeza del animal con una navaja y crema depilatoria. Lave la piel con agua para eliminar cualquier residuo.

Para experimentos con modelos tumorales BLI, inyecte 150 microlitros de D-luciferina por vía intraperitoneal con una jeringa de insulina de calibre 29. Para la administración de microburbujas para la apertura de BBB, inserte un catéter de vena de cola de calibre 26 a 30 y enjuague la vena con un pequeño volumen de solución de heparina. Asegure el catéter con cinta de tejido para evitar que se desprenda.

Si el cateterismo es exitoso, llene el catéter con la solución de heparina para evitar la coagulación de la sangre. Coloque al animal en la plataforma estereotáctica con temperatura regulada para evitar la hipotermia. Fije la cabeza del animal con una barra de mordida y barras para las orejas y pegue la cola y el catéter a la plataforma.

Fija el cuerpo del ratón con una correa. Coloque la plataforma estereotáctica con el ratón montado en la modalidad de imagen y tome imágenes del animal. Determine si el animal está colocado correctamente en la plataforma.

Marque la posición del animal utilizando los marcadores de referencia multimodales en combinación con la tubería de procesamiento de imágenes de acuerdo con el punto de enfoque del transductor. Determine el área objetivo colocando un contorno cerebral sobre la imagen de rayos X adquirida o usando imágenes BLI para determinar el centro del tumor. Antes de colocar el transductor, proteja las fosas nasales y la boca del animal con cinta adhesiva para evitar que el gel de ultrasonido interfiera con la respiración.

Aplique gel de ultrasonido en la parte superior de la cabeza del ratón para una correcta conducción del sonido. Registre la cavitación de microburbujas con el hidrófono de aguja, que se coloca en las proximidades directas del hueso occipital. En función de los valores de calibración, guíe el transductor a la posición correcta por encima del animal.

Aplique ajustes preconfigurados a todos los dispositivos conectados para dirigirse a la región cerebral de interés. Después de colocar el transductor en la posición correcta, disuelva y active las microburbujas como lo describe el fabricante. Antes de la inyección de microburbujas, enjuague el catéter de la vena de la cola con solución salina para confirmar el acceso a la vena de la cola.

Iniciar la trayectoria de insonicación e inyectar simultáneamente las microburbujas. Al mismo tiempo, el hidrófono de aguja detectará y verificará la cavitación de microburbujas en tiempo real. Si lo desea, administre un agente de contraste intravascular o fármaco después de la sonoporación.

Monitoree al animal hasta un punto de tiempo predeterminado. La presión acústica con un índice mecánico de 0,4 en combinación con microburbujas proporcionó un medio muy sensible y fiable para la detección de cavitación estable en comparación con la ausencia de detección de subarmónicos cuando no se inyectaron microburbujas o la observación de cavitación inercial cuando se aplicó un IM de 0,6. Mientras que la presión acústica con un IM de hasta 0,6 no produjo daño macroscópico, el daño microscópico se evidenció histológicamente con un IM de 0,6.

Una amplitud de presión con un IM de 0,8 dio lugar a una hemorragia cerebral macroscópica de vasos más grandes y a una lisis tisular generalizada con extravasación de eritrocitos. Se inyectó azul de Evans por vía intravenosa para validar la apertura de la BHE en la región pontina. Se observó extravasación de albúmina conjugada con azul de Evans a nivel de la protuberancia y el cerebelo en el ratón tratado con FUS y microburbujas, lo que demuestra una orientación precisa de la región de interés.

Los pasos más importantes de este protocolo son la correcta colocación del catéter de la vena de la cola, el posicionamiento y la focalización del animal, y la inyección de microburbujas con ultrasonido focalizado con detección de cavitación. Este sistema de ultrasonido focalizado de fabricación propia puede adaptarse y rediseñarse para múltiples preguntas de investigación, a la vez que es rentable y tiene un flujo de trabajo automatizado, lo que lo hace adecuado para investigadores relativamente inexpertos.